本发明专利技术公开了一种测定非同源末端连接修复活性的方法，该方法采用基因定点突变技术来对HPRT基因进行突变，之后需要质粒转染、药物处理、6-TG处理步骤，最后通过简单的细胞活力检测来观察NHEJ修复的活性，这种方法可以通过检测细胞活力来观察细胞NHEJ修复的活性水平，可用于筛选不同药物、不同基因对NHEJ修复的作用，测定不同细胞系对NHEJ活性抑制药物和基因的反应，从而可以发现具有化疗和放疗增敏效果的药物和基因。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，属于分子生物学领域。
技术介绍
非同源末端连接(Non-homologous end joining, NHEJ)是一种细胞修复DNA双链断裂的通路，该修复过程不需要模版染色体的参与，能够直接重新连接两个断裂的DNA末端。然而与另外一种同源重组(Homologous recombinat1n, HR)修复不同，NHEJ修复往往伴随着核苷酸的插入或缺失，从而使基因发生突变，失去基因的功能。DNA作为遗传信息的保存者，其完整性对细胞来说至关重要。多种内源或外源因素都能造成细胞基因组DNA损伤，细胞内具有应对不同形式损伤的复杂的修复系统。其中DNA双链断裂(DNA double-strand breaks, DSBs)作为最严重最致命的损伤形式，如果没有被及时修复，将导致细胞死亡。在肿瘤的临床治疗中，放疗和多数化疗药物可以导致肿瘤细胞DNA双链断裂，肿瘤细胞主要通过NHEJ和HR修复来对断裂的DNA双链进行修复，其中NHEJ不存在细胞周期依赖性，是细胞中修复DNA双链断裂的主要方式，其活性在一定程度上决定了肿瘤细胞对电离辐射和化疗药物的敏感性，当肿瘤细胞中的NHEJ修复活性被抑制后，放疗和化疗的效果能得到明显的改善。目前可以用来测定NHEJ活性的方法主要有DNA双链断裂特异性蛋白γ H2AX和53ΒΡ1染色，DNA断裂片段的中性彗星电泳，以及采用比较复杂的分子生物学手段来研宄NHEJ的活性，如在大范围核酸酶1-SceI基础上设计的针对NHEJ修复活性的报告质粒，转染细胞后筛选稳定表达细胞株，再引入1-SceI核酸酶进行DNA双链断裂的诱导，最后通过观察报告质粒的焚光表达来反应NHEJ修复的能力(Identificat1n ofNovel Rad1sensitizers in a High-Throughput, Cell-Based Screen for DSB RepairInhibitors，Alexander G，《Molecular Cancer Therapeutics》第 14 卷，第 326-342 页，2015年2月)。但是上述这些方法比较复杂且步骤繁多，而且需要一些特异性的染色以及对特定细胞株的筛选。基因组定点编辑技术目前发展迅速，现在主要有三种类型，锌指核酸内切酶(Zinc finger nucleases, ZFNs)，类转录激活因子效应物核酸酶(Transcript1nactivator-like effector nucleases，TALENs)，规律性重复短序列丛集及其系统(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR/CRISPRassociated system, Cas9)，这些技术可以对基因组中特定的DNA位点进行切断，通过诱导NHEJ或HR修复来达到对基因定点编辑的目的，而且突变效率高、制作简单、成本较低。因此如何利用基因组定点编辑技术来简明的测定非同源末端连接修复活性成为当前亟待解决的问题。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供。次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Hypoxanthine-guaninephosphoriboSyItransferase, HPRT)参与细胞内嘌呤核苷酸生物合成的补救途径，6_硫代鸟嘌呤(6-Th1guanine，6-TG)能在该酶的作用下掺入DNA中，从而抑制DNA合成，使细胞无法存活。如果用上述基因定点编辑技术在HPRT基因上造成DNA双链断裂，当HPRT基因通过NHEJ修复发生突变后，可使细胞在含有6-TG的培养基中存活，而没有发生NHEJ修复而突变的细胞则不能在含有6-TG的培养基中存活，这样存活细胞的数量及活力就反映了 NHEJ修复水平的高低。本专利技术的原理是采用基因定点突变技术(ZFN，TALEN或CRISPR/Cas9)在HPRT基因上诱导DNA双链断裂，当HPRT基因的断裂点发生NHEJ修复时，会发生基因突变，导致细胞内HPRT功能失活。正常细胞在HRPT失活后并不会影响细胞的功能，但是在含有6-TG的培养基中，6-TG可以在HPRT的作用下掺入DNA引起细胞死亡，而发生NHEJ后突变的细胞由于HPRT基因功能失活，可以抵抗6-TG的毒性而存活下来，最终可以通过检测细胞的活力来了解细胞的NHEJ修复活性。本专利技术的技术方案是:，包括下述步骤:，包括下述步骤:(I)采用TALEN技术或CRISPR/Cas9技术构建针对次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因的质粒；(2)对(I)中构建所得的质粒结合哺乳动物细胞采用非同源末端连接修复分子抑制剂进行处理，得到经抑制处理的哺乳动物细胞；(3)将⑵中所得的哺乳动物细胞用含有6-硫代鸟嘌呤的DMEM培养基进行培养；(4)在经(3)处理好的哺乳动物细胞中加入MTT溶液，待蓝色甲臜颗粒形成后用DMSO溶解，然后采用酶标仪测定其在0D570nm的吸光值。其进一步的技术方案是:步骤(I)中采用TALEN技术构建针对次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因的质粒时，所设计打靶基因的左臂识别序列为SEQ ID NO: 1，设计打靶基因的右臂识别序列为SEQID N0:2o步骤(I)中采用CRISPR/Cas9技术构建针对次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因的质粒时，所设计的靶点引物的正向引物序列为SEQ ID N0:3，所设计的靶点引物的反向引物序列为SEQ ID NO:4。步骤(2)中所述哺乳动物细胞为293T细胞，所述非同源末端连接修复分子抑制剂为非同源末端连接修复分子DNA-PK的抑制剂NU7441和DNA-PKcs siRNA中的一种，且所述DNA-PKcs siRNA 的基因序列为 SEQ ID N0:5。步骤(2)中对(I)中构建所得的质粒结合哺乳动物细胞采用非同源末端连接修复分子抑制剂进行处理是指:将步骤(I)中构建所得的质粒转染293T细胞并对转染后的293T细胞采用非同源末端连接修复分子DNA-PK抑制剂NU7441处理。步骤⑵中进行质粒转染的过程包括:将293T细胞接种在培养皿中，当该细胞密度达到70%时，采用Lipofectamine 3000作为转染试剂将(I)中构建所得的质粒转染293T细胞。步骤⑵中对⑴中构建所得的质粒结合哺乳动物细胞采用非同源末端连接修复分子抑制剂进行处理是指:将步骤(I)中构建所得的质粒和DNA-PKcssiRNA共转染293T细胞。步骤(2)中进行质粒转染的过程包括:将293T细胞接种在培养皿中，当该细胞密度达到70%时，采用Lipofectamine 3000作为转染试剂将(I)中构建所得的质粒和DNA-PKcs siRNA 共转染 293T 细胞。借由上述方案，本专利技术至少具有以下优点:本专利技术所述方法采用基因定点突变技术来对HPRT基因进行突变，之后需要质粒转染、药物处理、6-TG处理步骤，最后通过简单的细胞活力检测来观察NHEJ修复的活性，这种方法可以通过检测细胞活力来观察细胞NHEJ修复的活性水平，可用于筛选不同药物、不同基因对NHEJ修复的作用，测定不同细胞系对NHEJ活性抑制药物和基因的反应，从而可以发现具有化疗和放疗增敏效本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种测定非同源末端连接修复活性的方法，其特征在于：包括下述步骤：(1)采用TALEN技术或CRISPR/Cas9技术构建针对次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因的质粒；(2)对(1)中构建所得的质粒结合哺乳动物细胞采用非同源末端连接修复分子抑制剂进行处理，得到经抑制处理的哺乳动物细胞；(3)将(2)中所得的哺乳动物细胞用含有6‑硫代鸟嘌呤的DMEM培养基进行培养；(4)在经(3)处理好的哺乳动物细胞中加入MTT溶液，待蓝色甲臜颗粒形成后用DMSO溶解，然后采用酶标仪测定其在OD570nm的吸光值。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘芬菊，杜杰，俞家华，张昊文，尚增甫，张钰烁，
申请(专利权)人：苏州大学张家港工业技术研究院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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