本发明专利技术公开了一种应用FMYYSSR-2分子标记技术鉴定烟草原料的方法，属于分子生物学研究领域。本发明专利技术在经过烟草基因数据信息筛选后，确定以FMYYSSR-2标记，对样品是否为烟草进行鉴定。在以十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法，对各个样品的DNA进行提取后，以本发明专利技术所设计的引物对其进行PCR扩增，在经过电泳分析后，确定烟草物种的特异性条带位置，视待测样品在相应位置有无扩增条带产生来判断该样品是否为烟草。由于本方法以烟草物种DNA的特异性作为鉴定依据，因此与传统鉴定方法相比，有更加客观、更加准确、更加可靠的优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学研宄领域，具体是一种以FMYYSSR-2标记（即分子标记技 术）对烟草原料进行鉴定的方法，由于本方法以烟草物种DNA的特异性作为鉴定依据，因此 与传统鉴定方法相比，有更加客观、更加准确、更加可靠的优势。
技术介绍
在烟草原料的鉴别检验工作中，多是通过外观判断、评吸等手段进行烟草原料鉴 定，个别烟草原料鉴别检验涉及相关的化学成分检测。但就目前来看，部分形态的烟草原料 (如烟丝、烟沫等)，很难从外观上进行鉴别检验，烟草与其他植物之间、各烟草种类之间也 很难完全以化学成分检测及评吸来进行鉴别；而且上述鉴别要求检验人员不仅需要掌握相 关的原料特性、化学成分分析方法、感官评吸技术，还需具备烟草原料生产和分级技能，检 验人员的培训难度大；另外，烟草原料本身的霉变和不法分子所采取的染色、加香加料等手 段，也加大了检验人员进行准确鉴定的难度。DNA分子标记技术属于分子生物学研宄范畴，是从DNA水平区分不同物种甚至是 同一物种不同个体之间的选择性标记技术。自上世纪80年代以来，随着聚合酶链式 反应（PCR)技术的出现，DNA分子生物学研宄发展迅猛，目前DNA分子标记技术已有数十 种之多，如限制性片段长度多态性标记（RestrictionFragmentLengthpolymorphism, RFLP)、随机扩增多态性标记（RandomAmplifiedPolymorphicDNA,RAH))?、序列特异 性扩增区域标记（SequenceCharacterizedAmplifiedRegions,SCAR)、内含子长度多 态性标记（intron-lengthpolymorphism,ILP)、单核苷酸多态性（SingleNucleotide Polymorphism，SNP)、简单序列重复标记（SimpleSequenceRepeats,SSR)等。由于 在DNA分子水平，不同物种间甚至是同一物种不同个体之间都能得到很好的区分，因此DNA 分子标记技术作为物种分类鉴定的一种手段，已被广泛地应用于属间、种间、品种间的分类 鉴定和亲缘关系研宄中，几乎可以对所有的生物种类进行分类鉴定 ，在目前物种鉴定 技术中发展最快，也最为热门。表1列出了DNA分子标记技术在各类鉴定中的应用。 表1DNA分子标记技术在各类鉴定中的应用目前的烟草原料鉴别检验技术，以样品的外观、口感及化学成分特征为基础，只能外 在、间接地反映烟草物种的特性，导致目前的鉴别检验易受外界环境、检验人员主观感受 差异、加工条件及烟草本身器官组织变化等因素的影响，准确性、可靠性有较大局限；而以 DNA分子标记技术进行烟草原料鉴定，是以烟草基因组序列信息为基础，可内在、直接地反 映烟草的特性，以其进行鉴别检验不受上述诸多因素的影响。因而以DNA分子标记技术来 对烟草原料进行鉴定，无疑将会更加准确、可靠。 中国专利公开了云南红云红河集团申报的一种应用SSR分子标记技术鉴定商品 卷烟的方法，通过识别单品种或混合品种的特征条带，掌握所鉴定样品的原料品种组成，达 到辨别真伪的目的。 随着基因组学的迅速发展，越来越多的动植物基因组已经被测序出来。迄今为 止，在前科里，已有栽培番前（Solanumlycopersicum)，马铃薯（Solanumtuberosum)， 辣椒（Capsicumannuum)，本氏烟（Nicotianabenthamiana)，潘那利番前（Solanum pennellii)，野生醋栗番前（Solanumpimpinellifolium)，（Nicotianatabacum)等的基因 组序列或基因组草图被公布出来。这为我们开发烟草特异的分子标记提供了可能。作为面 向市场和应用、具有权威性和法律效应的鉴定技术，必须准确可靠，简单易行。基于SSR的 分子标记，通过PCR扩增和凝胶电泳就可较为方便的完成样品检测。而其他基于SNP等的 分型手段，还必须经过sanger测序等一系列方式，增添不必要的成本和步骤。
技术实现思路
本专利技术的目的正是基于上述现有技术状况而提供的一种以FMYYSSR-2标记对烟 草原料进行鉴定的方法。 本专利技术的研宄过程及原理在于：广泛收集了目前在烟草中已经开发和发表的SSR 标记，作为筛选和过滤的基础。具体分析步骤包括：1、取拟南芥、本氏烟（国际上普遍采用 的一种模式烟草种，与普通烟草亲缘关系较近）、栽培烟草、番茄和土豆作为参考序列，将候 选标记进行比对；2、过滤掉能和拟南芥、番前和土豆能比对上的SSR标记。3、选取能和本氏 烟、栽培烟草均能比对上，且扩增序列单一的SSR标记。4、筛选的标记扫描美国国立生物技 术信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformationNCBI)数据库的所有物种 基因序列信息，验证上述引物在烟草中的特异性。经过筛选，最终确定以FMYYSSR-2标记， 对样品是否为烟草进行鉴定。 本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的： 一种以FMYYSSR-2标记对烟草原料进行鉴定的方法，在以十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB)法，对各个品种标准烟草样品的DNA进行提取后，以所设计的引物对其进行PCR扩 增，在经过电泳分析后，确定烟草物种的特异性条带位置；再以同样的方法对样品进行处理 后，视其在相应位置有无条带产生来判断该样品是否为烟草，具体步骤如下： 1) FMYYSSR-2标记的引物设计，上下游引物序列分别为TGCACATAGGAAACACTTTAGTACA 和TTGAGATTTGGGTTCTTACCAA; 2) 烟草样品及待测样品DNA提取：（1)取不同样品分别将其组织碾磨成细粉末，放入2 mL离心管中。（2)加入600~800yL的CTAB提取缓冲液，混匀（CTAB在65°C水浴预热)，每 3~5min轻轻震荡几次，20min后12000r/min离心10~15min。（3)小心吸取上清液，加 入等体积的苯酷：氯仿(各400yL)溶液，混勾，4 °C，12000r/min，离心10~15min;(4)小 心吸取上清液，加入等体积的氯仿，混勾，4 °C，12000r/min，离心10~15min，重复2~3次， 以蛋白层不出现为止。（5)取上清，-20 °C沉淀1~2h，4 °C，12000r/min，离心10~15min; (6)弃去上清液，用50%~70%乙醇洗涤沉淀2次；室温下干燥后（一般干燥10~15min)， 于-20 °C或者-70 °C下保存备用。 3)PCR反应按以下程序进行：解链温度95°C，30秒，退火温度55°C，30秒，延伸温 度68 °C，30秒，重复35个循环。 4)取25yL的PCR产物凝胶电泳分析，在确定烟草物种的特异性条带位置后，视 样品在相应位置有无条带产生来判断该样品是否为烟草。结果如图1所示。从电泳结果可 以看出，所有烟草样品均能扩出明显的特异性条带(约200bp处)，该条带在样品1-4中均 能扩出，在样品5-8中均未见扩出。这说明样品1-4为烟草，样品5-8为非烟草。 本专利技术相比现有技术的优点在于：本方法以烟草物种DNA的特异性作为鉴定依 据，因此与传统鉴定方法相比，有更加客观、更加准确、更加可本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种以FMYYSSR‑2标记对烟草原料进行鉴定的方法，其特征在于：在以十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法，对各个品种标准烟草样品的DNA进行提取后，以所设计的引物对其进行PCR扩增，在经过电泳分析后，确定烟草物种的特异性条带位置；再以同样的方法对样品进行处理后，视其在相应位置有无条带产生来判断该样品是否为烟草，具体步骤如下：1）FMYYSSR‑2标记的引物设计，上下游引物序列分别为TGCACATAGGAAACACTTTAGTACA和TTGAGATTTGGGTTCTTACCAA；2）烟草样品及待测样品DNA提取；(1) 取不同样品分别将其组织碾磨成细粉末，放入2 mL离心管中；(2) 加入600~800 μL的CTAB提取缓冲液，混匀，在CTAB在65℃水浴预热，每3~5 min轻轻震荡几次，20 min后12000 r/min离心10~15 min；(3) 小心吸取上清液，加入等体积的苯酚：氯仿溶液各400 μL，混匀，4 ℃，12000 r/min，离心10~15 min；(4) 小心吸取上清液，加入等体积的氯仿，混匀，4 ℃，12000 r/min，离心10~15 min，重复2~3次，以蛋白层不出现为止；(5) 取上清，‑20 ℃沉淀1~2 h，4 ℃，12000 r/min，离心10~15 min；(6) 弃去上清液，用50%~70%乙醇洗涤沉淀2次；室温下干燥10~15 min后，于‑20 ℃或者‑70 ℃下保存备用；3）PCR反应按以下程序进行：解链温度95℃，30秒，退火温度55℃，30秒，延伸温度68℃，30秒，重复35个循环；4）取25 μL的PCR产物凝胶电泳分析，在确定烟草物种的特异性条带位置后，视样品在相应位置有无条带产生来判断该样品是否为烟草。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张威，刘楠，罗安娜，王英元，冯晓民，何声宝，胡清源，邢军，侯宏卫，
申请(专利权)人：国家烟草质量监督检验中心，
类型：发明
国别省市：河南;41
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