本发明专利技术公开了一种肺癌辐射抗性细胞株的构建方法，该方法包括以下步骤：肺癌细胞常规培养至对数生长期时，接种于六孔板中，把六孔板置于照射野中心，六孔板底面覆盖1.5cm厚的组织等效填充物，6MV-X线垂直入射，剂量率300cGy/min，源皮距100cm，依次给予2Gy、4Gy、6Gy、8Gy和10Gy照射，每剂量均照射2次，总剂量达60Gy，继续培养及传代5代以上至细胞形态、增殖稳定，冻存备用。本发明专利技术照射次数少，构建时间短，细胞污染几率小，优于小剂量等分割照射法；集落形成实验结果表明采用本发明专利技术构建肺癌辐射抗性细胞株的辐射抗性高于亚致死剂量照射法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞生物学领域，具体地说是涉及一种具有稳定辐射抗性的肺癌辐射 抗性细胞株的构建方法。
技术介绍
肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，2014年国家癌症中心发布《中国肿瘤登记年 报》报道，肺癌在我国恶性肿瘤中发病率居第一位，每年新发病例约60万，死亡病例约49 万。放射治疗是目前肺癌多学科综合治疗的重要手段之一，统计显示超过70%的患者在诊 疗过程中要接受放射治疗。然而，虽经各种手段综合治疗，肺癌疗效总体差强人意，5年生存 率长期徘徊于15%左右，亟待改善。肿瘤复发和转移是肺癌放射治疗失败的主要原因，现有 研宄认为，肺癌放射治疗后残留细胞，即肺癌辐射抗性细胞侵袭力和转移活性增强，是肿瘤 复发和转移的根源。因此，构建肺癌辐射抗性细胞体外模型，对提高肺癌治疗疗效具有重要 意义。目前用于构建肺癌辐射抗性细胞的方法主要有小剂量等分割照射法和亚致死剂 量照射法，其中小剂量等分割照射法因照射次数较多、构建周期需一年以上，细胞污染几率 大，稳定传代成系较难。亚致死剂量照射法是采用使肺癌细胞DNA单链断裂的亚致死剂量 1次性照射，例如分别给予肺癌A549和H1299细胞亚致死剂量6. 5Gy和5. 5Gy的1次性照 射。但目前临床常规剂量分割放射治疗总剂量应不低于60Gy，亚致死剂量照射法与现有临 床放疗模式相差较大，因此采用此法构建的肺癌辐射抗性细胞无法最大限度模拟临床复发 癌放射生物学特性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种具有稳定辐射抗性的肺癌辐射抗性细胞株的构建方法， 照射次数少，构建周期短，细胞污染几率小，构建的辐射抗性细胞株能模拟临床复发癌放射 生物学特性。 为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种肺癌辐射抗性细胞株的构建 方法，包括以下步骤： ①将肺癌细胞置于37°C、5%C02培养箱内常规培养，当其覆盖培养瓶60~70%并 处于对数生长期时，接种于六孔板中，把六孔板置于照射野中心，六孔板底面覆盖1. 5cm厚 的组织等效填充物，照射源为医用直线加速器，6MV-X线，机架旋转180°，在室温条件下射 线从下方垂直入射，剂量率300cGy/min，源皮距SSD= 100cm，第1次予以2Gy照射； ②照射后更换新鲜培养基，待细胞覆盖培养瓶80%以上时，胰酶消化，传代两次以 上；③传代后置于37°C、5%C02培养箱内培养2~3天，待细胞再次覆盖培养瓶60~ 70 %后，再次给予2Gy照射； ④每一次照射后的细胞均按上述步骤②和步骤③的方法传代并培养至稳定状态 后再进行照射，依次增加照射剂量达4Gy、6Gy、8Gy和lOGy，每剂量均照射2次，总剂量达 60Gy，继续培养及传代5代以上至细胞形态、增殖稳定，冻存备用。 进一步，所述六孔板中每孔细胞接种量为5X105个。 进一步，所述医用直线加速器为Varian23-EX医用直线加速器。 进一步，所述X线的照射野大小为30cmX30cm。 本专利技术的技术方案有如下有益效果： 1、利用本专利技术构建肺癌辐射抗性细胞株，总共进行射线照射10次，照射次数少； 构建周期约6个月，时间短；且因细胞从细胞无菌培养室外置于放射治疗室的次数较少，细 胞污染几率小，优于小剂量等分割照射法； 2、集落形成实验是目前国际公认的检测细胞辐射抗性的金标准。本专利技术采用集落 形成实验检测细胞的辐射抗性，结果表明采用本专利技术构建的肺癌辐射抗性细胞株的平均致 死量％、准阈剂量Dq和2Gy生存分数SF2均高于亚致死剂量照射法，即采用本专利技术构建肺 癌辐射抗性细胞株的辐射抗性高于亚致死剂量照射法； 3、本专利技术照射总剂量为60Gy，与现有临床放疗模式相近，构建的辐射抗性细胞株 能最大限度模拟临床复发癌放射生物学特性。【附图说明】 图1为本专利技术构建方法的流程图； 图2为A549细胞与辐射抗性A549R细胞在倒置光学相差显微镜（100倍放大）下 的形态图，其中，A为A549细胞形态图，B为A549R细胞形态图；图3为集落形成实验绘制的A549与辐射抗性细胞的细胞生存曲线图，其中A为单 靶多击模型，B为二次线性模型； 图4为H1299细胞与辐射抗性H1299R细胞在倒置光学相差显微镜（100倍放大） 下的形态图，其中，C为H1299细胞形态图，D为H1299R细胞形态图； 图5为集落形成实验绘制的H1299与辐射抗性细胞的细胞生存曲线图，其中C为 单靶多击模型，D为二次线性模型。【具体实施方式】 人肺腺癌细胞株A549和H1299,购于南京凯基生物有限公司，培养基为含10 %胎 牛血清（购于四季青公司）的1640培养基（购自赛默飞世尔生物化学有限公司），分别置 于37°C、5% 0)2培养箱内培养。 实施例1 如图1所示，，包括以下步骤： ①将人肺癌细胞株A549置于37°C、5%C02培养箱内常规培养，当其覆盖培养瓶 60~70%并处于对数生长期时，以每孔5X105个接种于六孔板中，把六孔板置于照射野中 心，六孔板底面覆盖1. 5cm厚的组织等效填充物，照射源为Varian23-EX医用直线加速器， 6MV-X线，机架旋转180°，在室温条件下射线从下方垂直入射，剂量率300cGy/min，源皮距 SSD= 100cm，照射野大小为30X30cm，第1次予以2Gy照射； ②照射后更换新鲜培养基，待细胞覆盖培养瓶80%以上时，胰酶消化，传代两次以 上； ③传代后置于37°C、5%C02培养箱内培养2~3天，待细胞再次覆盖培养瓶60~ 70 %后，再次给予2Gy照射； ④每一次照射后的细胞均按上述步骤②和步骤③的方法传代并培养至稳定状态 后再进行照射，依次增加照射剂量达4Gy、6Gy、8Gy和10Gy，每剂量均照射2次，总剂量达 60Gy，继续培养及传代5代以上至细胞形态、增殖稳定，即得到A549肺癌辐射抗性细胞，命 名为A549R(A549_radioresistance)细胞，冻存备用。...
【技术保护点】
一种肺癌辐射抗性细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：①将肺癌细胞置于37℃、5％CO2培养箱内常规培养，当其覆盖培养瓶60～70％并处于对数生长期时，接种于六孔板中，把六孔板置于照射野中心，六孔板底面覆盖1.5cm厚的组织等效填充物，照射源为医用直线加速器，6MV‑X线，机架旋转180°，在室温条件下射线从下方垂直入射，剂量率300cGy/min，源皮距SSD＝100cm，第1次予以2Gy照射；②照射后更换新鲜培养基，待细胞覆盖培养瓶80％以上时，胰酶消化，传代两次以上；③传代后置于37℃、5％CO2培养箱内培养2～3天，待细胞再次覆盖培养瓶60～70％后，再次给予2Gy照射；④每一次照射后的细胞均按上述步骤②和步骤③的方法传代并培养至稳定状态后再进行照射，依次增加照射剂量达4Gy、6Gy、8Gy和10Gy，每剂量均照射2次，总剂量达60Gy，继续培养及传代5代以上至细胞形态、增殖稳定，冻存备用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：姚元虎，章龙珍，邱祥南，张伟，李浩，覃朝晖，
申请(专利权)人：徐州医学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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