本发明专利技术公开了一种快速检测黄瓜棒孢叶斑病病原多主棒孢菌的LAMP引物组和检测方法。本发明专利技术针对黄瓜多主棒孢菌特异的毒素cassiicolin基因序列设计和筛选了一套特异性的检测引物组，该引物组由4条特异性引物CC-FIP、CC-BIP、CC-F3和CC-B3组成。本发明专利技术建立了含有该引物组的环介导等温扩增(LAMP)检测方法，检测结果可以通过肉眼直接观测，或以SYBR GreenⅠ的颜色变化作为判定标准，进而确定待检测样品中是否存在多主棒孢菌。本发明专利技术筛选到的引物灵敏度高、特异性强，建立的检测方法具有准确率好、检测时间短、仪器设备简单的优点，从样品处理到报告结果只需1.5h，不需要PCR仪和电泳仪，操作简单，比其它PCR方法具有更高的特异性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种快速检测多主棒孢菌的检测引物组和检 测方法。
技术介绍
多主棒抱（(Berk&M.A.Curtis)C.T.Wei)是一种重要 的植物病原真菌，可寄生于热带及亚热带地区的蔬菜、树木和园艺观赏作物。它主要危害植 物的叶片，形成典型的病斑，也可侵染根、茎、花和果实，严重时造成落叶、落果等现象。近年 来，我国蔬菜棒孢叶斑病的危害逐年加重，主要涉及黄瓜、茄子、番茄、菜豆等蔬菜和经济作 物橡胶等寄主，每年发生面积超过1000万亩，损失超过50亿，成为决定主要寄主产业发展 的重要限制因素。多主棒孢可以通过菌丝体、厚垣孢子或分生孢子的形式随病残体、杂草在 土壤中，非寄主植物上越冬存活，也可以附着于种子表皮或潜伏在种子内部，土壤传播和种 子带菌是多主棒孢远距离传播的主要途径。由多主棒孢引起的黄瓜棒孢叶斑病在叶片上症状多样，极易与其它病原菌引起的 病害相混淆，病原菌侵染不同时期，与黄瓜角斑病、霜霉病和炭疽病产生相似的症状。在田 间由于许多农民误、错诊，而没有对病害进行及时有效的控制，造成巨大的经济损失。因此， 建立黄瓜棒孢叶斑病的现场检测技术，对栽培期病害发生的预测预报具有重要的意义。 目前，植物组织中多主棒孢菌的检测主要沿用传统的组织分离培养、形态学特征 观察、致病力鉴定等方法，检测周期长，灵敏性低，易受人为及环境等诸多因素干扰，不易在 病害潜伏期和初发期作出及时正确的诊断。 近年来，随着分子生物学的发展，基于PCR技术的检测方法以成功应用于多种病 原菌的检测，虽然PCR技术具有特异性强和灵敏度高的优点，但其检测时间比较长，需要专 用PCR仪、电泳仪和专业操作人员实施和观测检测结果，检测过程复杂，技术难度高，难以 在基层大规模推广应用。 环介导恒温扩增（LAMP)是日本学者专利技术的一种新的基因高效扩增技术，不仅反应 体系简单，而且仅需要恒温条件即可完成，同时结果判别简单明了。LAMP反应体系由模板 DNA、2对特异性引物、BstDNA聚合酶、dNTPs和反应缓冲液构成，在65°C左右的恒温条件 下，BstDNA聚合酶催化引物反复进行高效的链置换反应和环介导扩增，整个反应约需60 min左右，大量合成目标DNA的同时伴随副产物的产生，反应管底部可见大量白色沉淀。LAMP方法与PCR技术相比，具有检测时间短，灵敏度和特异性高，操作简单， 仅仅需要普通水浴锅就可以完成检测等优点。目前，LAMP方法已经成功应用于多种植 物病原微生物的检测，如萌芦卷叶病毒、番茄黄花曲叶病毒、柑橘溃疡菌（Xa/?从 campestris')、HjTM{Fusariumgraminearum)、灰霉儀[Botrytisciflerea)、小麦叶锈病 菌（/icciflia 等，在病害发病初期即可快速的对病害进行诊断，及时指导农 民采取有效的防治措施。而对于多主棒孢菌的LAMP检测方法的建立目前还没有报道。 本专利技术利用多主棒孢菌特异性的毒素cassiicolin基因序列特征设计了 4条特异 性的LAMP引物，在此基础上建立多主棒孢菌的LAMP检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是建立一种多主棒孢菌的特异性好、灵敏度高、快速简单的环介导 等温扩增检测技术，
技术实现思路
涉及多主棒孢菌的特异性引物组，和利用该引物组建立的检 测方法。 一种快速检测多主棒孢菌的检测方法涉及的引物组，由4条特异性的引物组成， 分别为内引物CC-FIP和CC-BIP、外引物CC-F3和CC-B3。4条特异性的引物序列如下： 正向外引物CC-F3 (5'to3'）：GAAGGTAGGCTTCITTCCCG(如SEQIDNO. 1 所示）； 正向内引物CC-FIP(5'to3'）：ATAACGGCTACGCACAGCGGCITTTGCCCCCGCGA TTC(如SEQIDNO. 3 所示）； 反向内引物CC-BIP(5 'to3'）：GCACTGAGGGGCAAITTGCATGGAGITGGCGAATG TCCGG(如SEQIDNO. 4 所示）。 所述的引物组合在检测多主棒孢菌中应用。 所述的待检样品可以为黄瓜组织或者真菌纯培养物。 所述的通过环介导等温扩增的方法利用上述特异性的引物组，反应体系的总体积 为 25yL，包括 2.5yLlXThermol反应缓冲液、1.5yL1.4mMdNTPs、0.5yL0.2yM正 向外引物CC-F3、0. 5yL0. 2yM反向外引物CC-B3、2yL1.6yM正向内引物CC-FIP、2yL 1.6yM反向内引物CC-BIP、lyL0.8mM甜菜碱、13yL灭菌双蒸水，0.5yL8U/yLBst DNA聚合酶和1.5yLDNA模板。反应条件为65°C水浴锅中恒温反应60min，然后80°C2min 终止反应。 所述的扩增产物的检测，可以利用电泳检测、荧光显色检测或浊度检测。优选用荧 光显色检测，具体是等温扩增后，扩增反应管中加入SYBRGreenI显色剂0. 25yL，5min后 肉眼直接观察结果，如果颜色为橙色，则样品阴性，无多主棒孢菌，如果颜色为绿色，则样品 阳性，含有多主棒孢菌。 所述的lXThermol反应缓冲液是现有技术中的物质，可以从试剂公司购买到，其 含有20mmol/LpH8. 8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl)、10mmol/L氯化钾（KC1)、 10mmol/L硫酸铵（NH4)2S04、2mmol/L硫酸镁（MgS04)和 0? 1% 曲拉通X-100(TtitonX-100)， 余量为灭菌双蒸水。 本专利技术根据多主棒孢菌特异的毒素cassiicolin靶基因序列设计和筛选了一套 特异性检测引物组，并通过环介导等温扩增的方法，确定待检测样品中是否存在多主棒孢 菌。 与现有技术相比，本专利技术具有以下优点： (1)成本低、操作简单。本专利技术最大的优点是不需要以往PCR检测所需要的PCR仪、 电泳仪、凝胶成像系统等昂贵的专业仪器，仅需一台恒温仪器，如水浴锅即可；本专利技术不需 要PCR检测中繁琐的操作步骤和规程，简单易行。 (2)检测快速。应用本专利技术的检测方法，可在1. 5h内得到检测结果，而以往的PCR 或巢式PCR检测需4~6h才可得到检测结果；本专利技术所述方法大大缩短了操作时间，方便 快速。 (3)检测结果肉眼可直接判断。本专利技术扩增产物加入显色剂染色后，绿色为阳性， 即待测样品中含多主棒孢菌；橙色为阴性，待测样品中不含多主棒孢菌。无需电泳检测及凝 胶成像系统。 (4)特异性强：本专利技术设计的引物组是该技术的关键，该引物组根据多主棒孢菌特 异性的毒素cassiicolin基因设计得到，引物组包含4条特异性的引物，可识别靶标序列上 的6个独立区域，相对于PCR反应的2个独立区域而言，特异性和灵敏度都大大提高。 本专利技术建立的多主棒孢菌LAMP检测方当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于快速检测黄瓜棒孢叶斑病病原菌多主棒孢的环介导等温扩增引物，其特征在于，所述的引物为外引物CC‑F3和CC‑B3，内引物CC‑FIP和CC‑BIP，其引物的核酸序列为分别为 SEQ ID NO：1‑4。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：高苇，王勇，张春祥，王万立，郝永娟，刘春艳，霍建飞，刘晓琳，
申请(专利权)人：天津市植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12
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