本发明专利技术公开了斯氏艾美耳球虫病毒的核酸序列，同时还提供斯氏艾美耳球虫体内表达外源基因的一种RNA转染系统，所述的耳球虫病毒基因组dsRNA全长cDNA序列6219bp。所构建的转染系统含有多克隆酶切位点，方便外源基因在斯氏艾美耳球虫体内的表达。该病毒转染系统的构建，为研究斯氏艾美耳球虫基因功能和生物学特性提供了有利的工具。
【技术实现步骤摘要】
【专利说明】
:本专利技术公开了斯氏艾美耳球虫病毒的核酸序列，及一种以斯氏艾美耳球虫病毒RNA为载体的外源基因在斯氏艾美耳球虫体内表达的转染系统，属于基因工程领域。
技术介绍
:兔球虫病是由艾美耳属球虫引起的一种寄生性原虫病。已经报道的感染家兔的艾美耳属球虫有17种，其中斯氏艾美耳球虫Es)的致病力最强、危害最大。它寄生于兔的肝胆管上皮细胞，能引起严重的肝球虫病，对养兔业的危害最大。长期以来，兔球虫病主要依靠化学药物进行治疗，由于球虫极易产生耐药性，给药物防治也带来了困难。其主要原因就是缺乏一种研宄斯氏艾美耳球虫细胞和分子生物学特征的基因工程工具。早在1989年就已报道在斯氏艾美耳球虫体内观察到了病毒粒子的存在，但目前仍未见关于斯氏艾美耳球虫病毒核酸序列及以斯氏艾美耳球虫病毒RNA为载体的转染系统的报导。
技术实现思路
:本专利技术所述的一种斯氏艾美耳球虫病毒的核酸序列，基因序列如SEQ n0.1所示，其全长为6219bp，含有2个开放阅读框(open reading frames (ORF))，之间有四个碱基的重叠。其开放阅读框前39Ibp为5’非编码区，第392bp到279Ibp为ORFl，编码800个氨基酸的衣壳蛋白，理论相对分子量为86.471 kDa。第2788bp到6090bp为0RF2，编码1101个氨基酸的RNA依赖RNA聚合酶蛋白，理论相对分子量为118.850 kDa。第6091bp到6219bp为3’非编码区。本专利技术所述的一种斯氏艾美耳球虫病毒转染载体，该转染系统含有多克隆酶切位点，方便外源基因转入斯氏艾美耳球虫体内，对其基因表达调控、基因功能及生化代谢等特征的研宄。本专利技术所述的一种斯氏艾美耳球虫病毒转染载体的构建方法，包括以下步骤:1)通过PCR扩增在5’非编码区前端引入T7启动子，将含有外源基因和多克隆酶切位点的基因序列替换斯氏艾美球虫病毒基因组的部分编码区； 2)应用T7 RiboMAX (TM) Express Large Scale RNA Product1n System 进行体外转录;3)将体外转录的RNA电穿孔至斯氏艾美耳球虫未孢子化卵囊内进行外源基因的表达。本专利技术的有益效果在于:提供了斯氏艾美耳球虫病毒基因组dsRNA全长cDNA序列6219bp。所构建的转染系统含有多克隆酶切位点，方便外源基因在斯氏艾美耳球虫体内的表达。该病毒转染系统的构建，为研宄斯氏艾美耳球虫基因功能和生物学特性提供了有利的工具。【附图说明】:图1A，图1B，图1C分别为含绿色荧光蛋白(EGFP)的EsRVl RNA转染载体的构建，含红色荧光蛋白(RFP)的EsRVl RNA转染载体的构建，含绿色荧光蛋白(EGFP)及红色荧光蛋白(RFP)的EsRVl RNA转染载体的构建；图2 A，图2B，图2C为本专利技术检测绿色荧光蛋白及红色荧光蛋白在球虫体内的表达。【具体实施方式】:通过以下实施例进一步举例描述本专利技术，并不以任何方式限制本专利技术。下面用实施例来进一步说明本专利技术的实质性内容，但本专利技术的内容并不局限于此。实施例1含绿色荧光蛋白(EGFP)的斯氏艾美耳球虫病毒RNA转染载体的构建如附图1A所示，根据斯氏艾美耳球虫病毒(EsRVl)基因组dsRNA的序列特征，将绿色焚光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)基因替换 dsRNA 的第 452 位到5985位核酸序列，构建EsRVl与EGFP的转染载体。用PCR扩增反应将T7启动子引入到dsRNA cDNA的5’非编码区的前端的同时，用PCR方法从EsRVl dsRNA cDNA扩增EsRVl的5’ 端 451bp (包括 5’ UTRs)，3’端 234bp (包括 3’ UTRs)及从实验室保存的 pMD18-T_Green质粒扩增EGFP编码区序列(717bp)。将三个片段分别克隆到pMD18-T载体上，得到重组质粒pEsRV451-EGFP-pEsRV234。重组质粒 pEsRV451_EGFP_pEsRV234 经 PCR 扩增后，PCR 产物凝胶回收，定量后作为模板，用 T7 RiboMAX? Express Large Scale RNA Product1n System进行体外转录。每管20μ?反应液包括:RiboMAX? Express T7 2XBuffer 10μ?，PCR纯化产物 8μ?，Τ7 Enzyme Mix 2μ?。37°C 反应 30min，加 IyL DNase 消化 DNA 模板，电泳观察转录结果后，在BTX电转杯中加入20μ? pEsRV451-EGFP-pEsRV234体外转录体RNA、5(^L未孢子化卵囊(I X 15个)和30μ? Cytomix溶液，冰浴15min后进行电转化。电转化条件为:电压500V、脉冲时间0.3ms间隔10ms连续进行三次电击反应。之后冰浴20min，将未孢子化卵囊转移至24孔板中，加入适量的重铬酸钾，于28.5°C温箱中进行孢子化。提取pEsRV451-EGFP-pEsRV234株孢子化卵囊的dsRNA，以此为模板进行RT-PCR扩增EGFP基因。同时提取孢子化后的虫体蛋白进行Western blot分析。结果均可检测到绿色荧光蛋白的表达(见附图2A)。说明可以利用斯氏艾美耳球虫病毒作为一种转染载体，携带外源基因在其体内表达。实施例2含红色荧光蛋白(RFP)的斯氏艾美耳球虫病毒RNA转染载体的构建如附图1B所示，根据斯氏艾美耳球虫病毒(EsRVl)基因组dsRNA的序列特征，将红色焚光蛋白(red fluorescent protein，RFP)基因替换dsRNA的第452位到5985位核酸序列，构建EsRVl与RFP的嵌合体。用PCR扩增反应将T7启动子引入到dsRNA cDNA的5’非编码区的前端的同时，用PCR方法从EsRVl dsRNA cDNA扩增EsRVl的5’端451bp (包括5’ UTRs)，3’端234bp (包括3’ UTRs)及从实验室保存的pMD18_T-Red质粒扩增RFP编码区序列(675bp)。将三个片段分别克隆到PMD18-T载体上，得到重组质粒pEsRV451-RFP-pEsRV234。重组质粒 pEsRV451_RFP_pEsRV234 经 PCR 扩增后，PCR 产物凝胶回收，定量后作为模板，应用 T7 RiboMAX? Express Large Scale RNA Product1n System进行体外转录。将pEsRV451-RFP-pEsRV234体外转录体RNA加入斯氏艾美耳球虫未孢子化卵囊Cytomix溶液中，终体积为100 μ I,使用BTX电转杯，以电压500V、脉冲时间0.3ms间隔10rns连续进行三次电击反应。冰浴20min之后，将未孢子化卵囊转移至24孔板中，加入适量的重铬酸钾，于28.5°C温箱中进行孢子化。提取pEsRV451-RFP-pEsRV234株孢子化卵囊的dsRNA，以此为模板进行RT-PCR扩增RFP基因。同时提取孢子化后的虫体蛋白进行Western blot分析。结果均可检测到红色荧光蛋白的表达(见附图2B)。说明可以利用斯氏艾美耳球虫病本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种斯氏艾美耳球虫病毒核酸的cDNA序列，其基因序列如SEQ no.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张西臣，信彩岩，武斌，才学鹏，李建华，宫鹏涛，杨举，李赫，张楠，尹继刚，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22
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