本发明专利技术公开了温度敏感型载体pBBR1MCS‑2‑Ts4及其应用。本发明专利技术所提供的温度敏感型载体pBBR1MCS‑2‑Ts4，是将SEQ ID No.1的第1557‑2526位所示的DNA片段替换为目的基因表达盒，并保持SEQ ID No.1的其他核苷酸不变，得到的重组载体；目的基因表达盒编码的蛋白质为将SEQ ID No.2所示的蛋白质进行A4)、保持SEQ ID No.2的其它氨基酸残基均不变得到的蛋白质的改造得到的蛋白质；A4)为如下A41)和/或A42)：A41)将SEQ ID No.2第25位的Lys突变为Glu；A42)将SEQ ID No.2第146位的Ile突变为Val。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
中。
技术介绍
把一段有用的目的DNA片段通过DNA重组技术，送进受体细胞中去进行复制和表 达的工具叫载体（Vector)。质粒是重组DNA技术中常用的载体，质粒存在于许多细菌以及 酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。一个理想的载体 大致应有下列一些特性：（1)分子量小、多拷贝、松弛控制型；（2)具有多种常用的限制性内 切酶的单切点；（3)能插入较大的外源DNA片段；(4)具有遗传标记，便于鉴定和筛选；（5) 对宿主细胞无害。 宽宿主质粒pBBRlMCS-2是应用性很广的载体，该质粒由pBBRl质粒改造而来。 pBBRl质粒来源于革兰氏阴性菌BordetellabronchisepticaS87(AntoineRandLocht C.Isolationandmolecularcharacterizationofanovelbroad-host-rangeplasmid fromBordetellabronchisepticawithsequencesimilaritiestoplasmidsfrom Gram-positiveorganisms.MolMicrobiol. 1992, 6 (13) : 1785-1799)。pBBRlMCS-2 含有一 个卡那霉素（kan)抗性筛选标记，它的大小仅有5145bp，这些特性使得该质粒适用于DNA克 隆、蛋白表达，广泛用于革兰氏阴性菌的分子操作。 温度敏感型质粒载体可以方便的控制质粒在宿主中的存在。当温度比较低时，质 粒可以存在宿主中，而当温度提高后，温度敏感型质粒载体将丢失或整合到染色体上。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何构建温度敏感型载体。 为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了构建重组载体的方法。 本专利技术所提供的构建重组载体的方法，是将SEQIDNo. 1的第1557-2526位所示 的DNA片段替换为目的基因表达盒，并保持SEQIDNo. 1的其他核苷酸不变，得到的重组 DNA即为所述重组载体，将该重组载体命名为pBBRlMCS-2-Ts3; 所述目的基因表达盒编码的蛋白质为将SEQIDNo. 2所示的蛋白质进行A4)的改 造、保持SEQIDNo.2的其它氨基酸残基均不变得到的蛋白质得到的蛋白质，即所述目的基 因表达盒编码的蛋白质为SEQIDNo. 10所示的蛋白质；所述A4)为如下A41)和/或A42):A41)将 SEQIDNo. 2 第 25 位的Lys 突变为Glu; A42)将 SEQIDNo. 2 第 146 位的lie突变为Val。 上述方法中，所述目的基因表达盒中的目的基因为将SEQIDNo. 1的第1794-2456 位核苷酸所示的DNA分子进行B4)的改造、保持SEQIDNo. 1的第1794-2456位核苷酸所 示的DNA分子中的其它核苷酸均不变得到的DNA分子；所述B4)为如下B41)和/或M2): B41)将 SEQIDNo. 1 第 1866 位的A 突变为G; B42)将 SEQIDNo. 1 第 2229 位的A 突变为G。 其中，SEQIDNo. 1由5145个核苷酸组成，SEQIDNo. 1的第1794-2456位核苷酸 为rep的编码基因，编码SEQIDNo. 2所示的rep蛋白。 上述方法中，所述目的基因表达盒的序列可为SEQIDNo. 9。 其中，SEQIDNo. 9的第238-900位编码SEQIDNo. 10所示的蛋白质。 上述方法中，所述目的基因表达盒中启动所述目的基因表达的启动子为将SEQID No. 1的第1557-1793位所示的DNA分子进行如下C2)、C3)和C4)这三种中至少一种的改 造、保持SEQIDNo. 1的第1557-1793位核苷酸所示的DNA分子中的其它核苷酸均不变得 到的DNA分子： C2)如下C21)和 / 或C22): C21)将 SEQIDNo. 1 第 1732 位的 A突变为G ; C22)将 SEQIDNo. 1 第 1780 位的 G突变为T ; C3)如下C31)和 / 或C32): C31)将 SEQIDNo. 1 第 1747 位的 C突变为T ;C32)将 SEQID No. 1第 1776 位的 T突变为A; C4)将SEQIDNo. 1 第 1751 位的T突变为A; 所述目的基因表达盒中终止所述目的基因表达的终止子为SEQIDNo.1的第 2457-2526位所示的DNA分子。 为解决上述技术问题，本专利技术还提供了由所述方法构建的重组载体。 为解决上述技术问题，本专利技术还提供了含有所述重组载体的重组微生物或重组细 胞系。 所述重组微生物具体可为细菌、酵母、藻和真菌。其中，所述细菌可为大肠杆 菌或类球红细菌。所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌EscherichiacoliT1、大肠杆菌 EscherichiacoliDH5a、大肠杆菌EscherichiacoliBW25113 或大肠杆菌Escherichia coliS17-1。所述类球红细菌具体可为类球红细菌Rhodobactersphaeroides2. 4. 1。 所述重组细胞系不包括繁殖材料。 为解决上述技术问题，本专利技术还提供了所述蛋白质。 为解决上述技术问题，本专利技术还提供了所述目的基因。 为解决上述技术问题，本专利技术还提供了DNA分子。 本专利技术所提供的DNA分子，为将SEQIDNo.1的第1557-1793位所示的DNA分子 进行所述C4)的改造、保持SEQIDNo.1的第1557-1793位核苷酸所示的DNA分子中的其 它核苷酸均不变得到的DNA分子。 为解决上述技术问题，本专利技术还提供了所述目的基因或所述DNA分子在制备温度 敏感载体中的应用。 为解决上述技术问题，本专利技术还提供了下述任一应用： L1、所述DNA分子在作为启动子中的应用； L2、所述重组载体在作为温度敏感载体中的应用。上述L2所述应用可为所述重组载体在大肠杆菌或类球红细菌中作为温度敏 感载体中的应用。所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌EscherichiacoliT1、大肠杆菌 EscherichiacoliDH5a、大肠杆菌EscherichiacoliBW25113 或大肠杆菌Escherichia coliS17-1。所述类球红细菌具体可为类球红细菌Rhodobactersphaeroides2. 4. 1。 本申请中，所述温度敏感载体为所述载体在一定温度下可存在于宿主中，而改变 温度后，所述载体不能存在于所述宿主中。具体可为所述载体在30°C下可存在于宿主中，当 温度为37°C-42°C时，所述载体不能存在于所述宿主中。 实验证明，本专利技术的重组载体PBBRlMCS-2-Ts4为温度敏感载体：在宿主菌 分别为大肠杆菌EscherichiacoliT1、大肠杆菌EscherichiacoliDH5a、大肠杆 菌EscherichiacoliBW25113 和大肠杆菌EscherichiacoliS17-1 时，pBBRlMCS-2 和pBBRlMCS-2-Ts4在30°CLB液体培养基和30°CLB+kan液体培养基中的丢失率以及 pBBRl本文档来自技高网...
【技术保护点】
构建重组载体的方法，是将SEQ ID No.1的第1557‑2526位所示的DNA片段替换为目的基因表达盒，并保持SEQ ID No.1的其他核苷酸不变，得到的重组DNA即为所述重组载体；所述目的基因表达盒编码的蛋白质为将SEQ ID No.2所示的蛋白质进行A4)的改造、保持SEQ ID No.2的其它氨基酸残基均不变得到的蛋白质：所述A4)为如下A41)和/或A42)：A41)将SEQ ID No.2第25位的Lys突变为Glu；A42)将SEQ ID No.2第146位的Ile突变为Val。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：江贤章，黄建忠，刘洪娇，周芬，张明亮，祁峰，陶勇，
申请(专利权)人：福建师范大学，
类型：发明
国别省市：福建;35
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