一种鉴定进出口海鱼中的异尖线虫幼虫的方法技术

本发明专利技术涉及一种鉴定进出口海鱼中的异尖线虫幼虫的方法，对异尖线虫单条线虫总DNA进行PCR扩增，获得其rDNA-ITS序列，测序后与基因库中DNA序列比较，并根据rDNA-ITS序列比较结果鉴定线虫的种类，最后通过酶切技术获得线虫的PCR-RFLP图谱并以此作为线虫鉴定的分子标签。本发明专利技术建立异尖线虫虫种分子生物学检测体系，以实现对其快速准确的鉴定，分析结果显示本发明专利技术方法判断准确，操作步骤简单，成本低、稳定性好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，特别涉及一种快速准确的鉴定进出口海鱼中的异尖线虫幼虫的方法。
技术介绍
异尖线虫病(Anisakiasis)是由于人食入寄生在海鱼体内的异尖线虫科某些种的活的第三期幼虫而引起的疾病，可表现为急腹症症状及过敏性症状。该病呈世界性分布，给人类健康构成严重威胁，是一种重要的人兽共患寄生虫病，也是我国禁止入境的二类寄生虫病。全球的人体感染病例已达3万多例并呈上升趋势。我国对此病报道极少，一方面和我国由异尖线虫引起过敏的情况较少有关，另一方面与我国居民大多不喜生食食物习惯有关，但随着吃海鲜、生鱼片等饮食时尚的兴起和渔业、旅游业的发展，异尖线虫病可能出现在我国生食海鱼的人群中。在日本、荷兰、英国、法国、德国以及太平洋地区等20多个国家有异尖线虫幼虫寄生与人体消化道各部位的报道，其中日本已报道人体病例14000余例。主要是这些国家居民喜吃腌海鱼或喜吃生拌海鱼片、鱼肝、鱼子或乌贼作佐酒佳肴，由此获得感染，使该病成为一种海洋自然疫源性疾病。我国尽管迄今尚未见有病例报告，但在国内市售海鱼中，发现鲐鱼、小黄鱼、带鱼等小型鱼体肌肉或器官组织内的异尖线虫幼虫感染率高达100％；从东海和黄海获得的30种鱼和两种软体动物发现带幼虫率为84％，可见我国人群感染异尖线虫病的潜在危险性很大。由于异尖线虫对人类健康的严重危害，该虫一直是我国出入境口岸检疫的传染病、寄生虫病病原。近年来，随着进出口贸易的快速发展，我国从国外进口越来越多的水产品。为确保这些水产品的安全，必须对异尖线虫等传染性病原进行检疫。目前，口岸动物检疫部门对异尖线虫幼虫的分类鉴定主要依靠形态学观察。
技术实现思路
本专利技术的目的在于现有对异尖线虫幼虫的分类鉴定主要依靠形态学观察，效率低下，错误率高的缺陷而提供一种快速准确的鉴定进出口海鱼中的异尖线虫幼虫的方法。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种鉴定进出口海鱼中的异尖线虫幼虫的方法，所述方法包括如下步骤：a)获得虫体样本：剖检进出境海鱼内脏表面和消化道而获得异尖线虫幼虫虫种，放入75％的酒精保存备用；b)样品总DNA的制备：将步骤a)得到的酒精中保存的异尖线虫幼虫用蒸馏水洗净后剪碎，加入500μL消化液，55℃作用12-20h，苯酚氯仿抽提，乙醇沉淀DNA，测定浓度后置-20℃保存；c)rDNA-ITS区PCR扩增：以步骤b)得到的DNA为扩增模板，用针对异尖线虫rDNA保守区的引物：NC5：5’-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3’(SEQ ID NO.1)和NC2：5’-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3’(SEQ ID NO.2)进行PCR扩增，目的片段为898-956bp；d)PCR产物酶切分析：根据已在GenBank注册的异尖科线虫ITS序列，经DNASTAR软件分析，将步骤c)得到PCR产物用HinfΙ和HhaΙ限制性内切酶进行RFLP分析，得到结果。作为优选，步骤b)中的消化液配方如下：5M NaCl 12.5μL；0.1MTris-HCl(pH＝8.0)50μL；0.1M EDTA(pH＝8.0)125μL；10％SDS 100μL；20mg/ml蛋白酶K2.5μL，蒸馏水210μL。作为优选，步骤c)中PCR扩增体系为50μL，其中：2μL模板DNA，10×PCR buffer5μL，25mmol/L dNTP 3μL，25mmol/LMgCl2 3μL，20μmol/L引物各0.75μL，0.5μL Taq酶，用双蒸水补足至50μL；扩增条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸80s共35个循环，最后72℃延伸7min；产物4℃保存，将扩增的产物用1.5％琼脂糖进行电泳检验。作为优选，步骤d)中，用HhaΙ酶切，反应体系如下：PCR纯化产物10μL，HhaΙ(10U/μL)1μL，10×M buffer 2μL，灭菌双蒸水补足至20μL；用HinfΙ酶切，反应体系如下：PCR纯化产物14μL，HinfΙ(10U/μL)1.5μL，10×H buffer 2μL，灭菌双蒸水补足至20μL。作为优选，步骤d)中，用HhaΙ与HinfΙ酶切，反应体系如下：PCR纯化产物12μL，HhaΙ(10U/μL)0.8μL，HinfΙ(10U/μL)1μL，10×M buffer 1.5μL，10×H buffer 1.5μL，灭菌双蒸水补足至20μL。作为优选，酶切温度37℃，水浴消化6h，酶切产物用1.5％琼脂糖进行电泳检验。本专利技术的有益效果：本专利技术利用异尖线虫幼虫总DNA为模板，用PCR扩增方法得到898-956bp大小的特异片段，利用DNASTAR软件对异尖线虫的ITS序列进行分析，选择两个限制性内切酶HinfⅠ和HhaΙ对异尖线虫的ITS序列进行酶切分析，分析结果显示本发明方法判断准确，操作步骤简单，成本低、稳定性好。附图说明图1是本专利技术异尖线虫rDNA-ITS序列的PCR扩增图。图中，M，100bp DNA Ladder Marker；1-5，A、B、C、D、E样品。图2是本专利技术异尖线虫rDNA-ITS序列的PCR产物HinfΙ酶切检测图。图中，M，100bp DNA Ladder Marker；1，空白.2，A.pegreffii.3，A.typica.4，A.simplex s s.5，Pseudoterranova decipiens.6，A.physeteris。图3是本专利技术异尖线虫rDNA-ITS序列的PCR产物HhaΙ酶切检测图。图中，M，100bp DNA Ladder Marker；1，A.typica.2，Pseudoterranova decipiens.3，A.physeteris.4，A.pegreffii.5，A.simplex s s.。具体实施方式下面通过具体实施例，对本专利技术的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本专利技术的实施例并不局限于下面的实施例，对本专利技术所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本专利技术保护范围。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。10×PCR Buffer、dNTP、Taq酶和限制性内切酶HinfΙ和HhaΙ均为大连宝生物公司产品。实施例1一种鉴定进出口海鱼中的异尖线虫幼虫的方法，所述方法包括如下步骤：a)获得虫体样本：剖检进出境海鱼内脏表面和消化道而获得异尖线虫幼虫虫种，编号A、B、C、D、E放入75％的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定进出口海鱼中的异尖线虫幼虫的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：a)获得虫体样本：剖检进出境海鱼内脏表面和消化道而获得异尖线虫幼虫虫种，放入75％的酒精保存备用；b)样品总DNA的制备：将步骤a)得到的酒精中保存的异尖线虫幼虫用蒸馏水洗净后剪碎，加入500μL消化液，55℃作用12‑20h，苯酚氯仿抽提，乙醇沉淀DNA，测定浓度后置‑20℃保存；c)rDNA‑ITS区PCR扩增：以步骤b)得到的DNA为扩增模板，用针对异尖线虫rDNA保守区的引物：NC5：5’‑GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT‑3’(SEQ ID NO.1)和NC2：5’‑TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT‑3’(SEQ ID NO.2)进行PCR扩增，目的片段为898‑956bp；d)PCR产物酶切分析：根据已在GenBank注册的异尖科线虫ITS序列，经DNASTAR软件分析，将步骤c)得到PCR产物用Hinf Ι和Hha Ι限制性内切酶进行RFLP分析，得到结果。

【技术特征摘要】
1.一种鉴定进出口海鱼中的异尖线虫幼虫的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
a)获得虫体样本：剖检进出境海鱼内脏表面和消化道而获得异尖线虫幼虫虫种，放入75％的
酒精保存备用；
b)样品总DNA的制备：将步骤a)得到的酒精中保存的异尖线虫幼虫用蒸馏水洗净后剪碎，
加入500μL消化液，55℃作用12-20h，苯酚氯仿抽提，乙醇沉淀DNA，测定浓度后置-20
℃保存；
c)rDNA-ITS区PCR扩增：以步骤b)得到的DNA为扩增模板，用针对异尖线虫rDNA保
守区的引物：
NC5：5’-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3’(SEQ ID NO.1)和
NC2：5’-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3’(SEQ ID NO.2)
进行PCR扩增，目的片段为898-956bp；
d)PCR产物酶切分析：根据已在GenBank注册的异尖科线虫ITS序列，经DNASTAR软件
分析，将步骤c)得到PCR产物用Hinf Ι和Hha Ι限制性内切酶进行RFLP分析，得到结果。
2.根据权利要求1所述的一种鉴定进出口海鱼中的异尖线虫幼虫的方法，其特征在于，步骤
b)中的消化液配方如下：5M NaCl 12.5μL；0.1MTris-HCl(pH＝8.0)50μL；0.1M EDTA(pH＝8.0)
125μL；10％SDS 100μL；20mg/ml蛋白酶K2.5μL，蒸馏水210μL。
3.根据权利要求1所述的一种鉴定进出口海鱼中的异尖线虫幼虫的方法，其特征在于，步骤
...

【专利技术属性】
技术研发人员：李孝军，白颉，周圆，陈璐敏，单长林，吴博，
申请(专利权)人：舟山出入境检验检疫局综合技术服务中心，
类型：发明
国别省市：浙江;33