肝癌早期诊断试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物检测领域，具体涉及一种肝癌早期诊断试剂盒及其应用。所述的诊断试剂盒组成如下:DCP标准品溶液，辣根过氧化物酶(HRP)标记的DCP单克隆抗体溶液，对照缓冲液，清洗缓冲液，底物液，显色液，终止液和DCP多克隆抗体包被酶标板。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物检测领域，具体设及一种。
技术介绍
国际卫生组织统计结果显示，2013年全球有101万肝癌新发病例，76万肝癌死亡 病例，男、女新发病例分别位于当年恶性肿瘤发病率的第五位及第^；：位，而男、女死亡病例 分别位于当年恶性肿瘤死亡率的第二位及第六位。在所有肝癌患者中，肝细胞癌为最常见 的一种组织学类型，占所有肝癌患者的70% -85%。 肝癌恶性程度高，病情发展迅速，若治疗不及时或治疗不当，则可使病情迅速恶化 而致死亡。近年来，随着人们生活方式的改变及其他各种因素的影响，我国肝癌发病率仍有 逐年上升趋势，我国每年死于肝癌的患者约有12万人，约占世界肝癌死亡人数的46%，目 前肝癌已经成为我国仅次于胃癌、食管癌第=位的恶性肿瘤死亡原因。 PIVKA-II(ProteinInducedbyVitaminKAbsenceorAntagonist-II)也被称 作脱-駿基凝血酶原值es-carbo巧-prot虹ombin,DCP),是一种异常的凝血酶原，最早于 1984年由Liebman从肝细胞癌化巧atoeellularcarcinoma,肥C)患者的血清中发现，其 形成的确切机制不明。与正常的凝血酶原相比，W往文献表明PIVKA-II和AFP没有相关 性，两者联合检测能提高阳性率。PIVKA-II，尤其是和AFP联合，可W作为肝癌早期检测 的一个理想标志物。 检测血清DCP受多种非特异物理吸附或者非特异结合的影响，比如凝血素、凝血 酶和纤维素及其类似物等的干扰比较大，因此多克隆DCP抗体在免疫分析上受到很大影 响，制约其应用。随着分子生物学和基因工程的发展，DCP抗体应用到免疫分析检测上，纯 化的DCP单克隆抗体的出现更是解决了交叉性大的问题。作为血清学标志物，DCP抗体出 现后，人们试图建立各种免疫分析方法用于DCP的检测.目前文献中报道的方法有：电化 学发光免疫分析技术、液相亲和免疫方法、免疫沉淀法、westernblot、ELISA等。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种灵敏度、特异度更高的肝癌早期诊断试剂盒。本专利技术的 技术方案如下：一种肝癌早期诊断试剂盒，所述的诊断试剂盒组成如下：DCP标准品溶液， 辣根过氧化物酶（HR巧标记的DCP单克隆抗体溶液，对照缓冲液，清洗缓冲液，底物液，显色 液，终止液和DCP多克隆抗体包被酶标板。 DCP标准品溶液为取相应量DCP标准品溶解于含有3g/LOVA的20mmol/L的PBS 缓冲液，DCP标准品浓度依次为lOmAU/l，80mAU/L，200mAU/L，800mAU/L和 2000mAU/L.[000引所述包被酶标板的制备过程为：将包被用DCP多克隆抗体用0. 05M碳酸盐缓冲液 (抑值为9.W稀释后加入酶标板各孔，每孔100y1，吸附过夜，用0. 05M磯酸盐缓冲液（pH 值为9. 5)洗板，再用封闭液封闭过夜，甩干后惊干，即获得单克隆抗体包被酶标板。所述封 闭液为含5g/L的明胶、0. 5g/L的庶糖和1. 5g/L的蛋清白蛋白（OVA)的20mmol/LPBS缓冲 液，抑值为9. 5。 辣根过氧化酶标记的DCP单克隆抗体溶液的制备方法为：先将2mgDCP单克隆 抗体和20mgHRP，加入1ml的lOOmmol/LPBS缓冲液加值7. 4)中，在4°C旋转混合，缓慢 加入4ml的1 %戊二醒溶液，25°C放置2小时，加入0. 1ml200mmol/L的赖氨酸溶液，4°C放 置化，装入透析袋，透析过夜，向透析产物加入等体积的60%甘油，混匀，加入终浓度为5g/ L的OVA。 对照缓冲液为20mmol/L的PBS(抑7. 4)缓冲液； 底物液为磯酸-巧樣酸缓冲液（pH7. 4)配制的3 %过氧化氨溶液，并且溶液中 0.Img/L的焦磯酸二氨钢；[001引显色液为四甲基联苯胺（TMB)的甲醇溶液，浓度为0.Img/ml;[001引终止液为3mol/L硫酸； 清洗缓冲液为15臟〇1/1的口85(口肪4)配制的0.05%吐温20溶液。 本专利技术所述肝癌早期诊断试剂盒对DCP的最低检测限可W达到2.OmAU/mU并且 稳定性极佳，在室温条件下可保存1年，在4°C下可保存3年。【具体实施方式】 下面将进一步的详细说明本专利技术。需要指出的是，W下说明仅仅是对本专利技术要求 保护的技术方案的举例说明，并非对该些技术方案的任何限制。本专利技术的保护范围W所附 权利要求书记载的内容为准。 下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，分子克隆实 验指南（SambrookJ,etal. 2008.MolecularCloning:AL油oratoryManual,化dEd.)中 所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。[001引实施例1 一种肝癌早期诊断试剂盒，所述的诊断试剂盒组成如下： DCP标准品溶液，辣根过氧化物酶（HR巧标记的DCP单克隆抗体溶液，对照缓冲液， 清洗缓冲液，底物液，显色液，终止液和DCP多克隆抗体包被酶标板.DCP标准品取相应量DCP标准品溶解于含有3g/LOVA的20mmol/L的PBS缓冲液， DCP标准品浓度依次为lOmAU/l，80mAU/L，200mAU/L，800mAU/L和 2000mAU/L. 所述包被酶标板的制备过程为：将包被用DCP多克隆抗体用0. 05M碳酸盐缓冲液 (抑值为9. 5)稀释后加入酶标板各孔，每孔100y1，吸附过夜，用0. 05M磯酸盐缓冲液（pH 值为9. 5)洗板，再用封闭液封闭过夜，甩干后惊干，即获得单克隆抗体包被酶标板。所述封 闭液为含5g/L的明胶、0. 5g/L的庶糖和1. 5g/L的蛋清白蛋白（OVA)的20mmol/LPBS缓冲 液，抑值为9. 5。 辣根过氧化酶标记的DCP单克隆抗体溶液的制备方法为：先将2mgDCP单克隆 抗体和20mgHRP，加入1ml的lOOmmol/LPBS缓冲液加值7. 4)中，在4°C旋转混合，缓慢 加入4ml的1 %戊二醒溶液，25°C放置2小时，加入0. 1ml200mmol/L的赖氨酸溶液，4°C放 置化，装入透析袋，透析过夜，向透析产物加入等体积的60%甘油，混匀，加入终浓度为5g/ L的OVA。 本实施例中DCP单克隆抗体和DCP多克隆抗体购自美国rapi化io(RB)公司。 对照缓冲液为20mmol/L的PBS(抑7. 4当前第1页1 2 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肝癌早期诊断试剂盒，所述的诊断试剂盒组成如下:DCP标准品溶液，辣根过氧化物酶(HRP)标记的DCP单克隆抗体溶液，对照缓冲液，清洗缓冲液，底物液，显色液，终止液和DCP多克隆抗体包被酶标板。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈立国，孙丽华，
申请(专利权)人：广州华弘生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44