用于胎儿血红蛋白再诱导的靶向BCL11A远端调控元件制造技术

本文提供了通过在基因组水平上破坏BCL11A表达以增加细胞中胎儿血红蛋白水平的方法以及组合物。本文还提供了涉及通过胎儿血红蛋白水平的再诱导来治疗血红蛋白病的方法以及组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于胎儿血红蛋白再诱导的靶向BCL11A远端调控元件相关申请的交叉引用根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2012年11月27日提交的美国临时申请号61/730,323、2012年11月27日提交的美国临时申请号61/730,369、2013年3月11日提交的美国临时申请号61/776,144以及2013年10月10日提交的美国临时申请号61/889,174的优先权，以引用的方式将它们的内容各自整体并入本文。政府支持本专利技术是在由美国国立卫生研究院授予的基金号5RO1HL032259的政府支持下完成的。美国政府对本专利技术享有一定的权利。
技术介绍
正常成体血红蛋白包含四个珠蛋白，两个为α蛋白，两个为β蛋白。在哺乳动物(特别是人类)胎儿发育期间，胎儿产生胎儿血红蛋白，其包含两个γ-珠蛋白而不是两个β-珠蛋白。在新生儿时期，被称为“胎儿转换(fetalswitch)”的珠蛋白转换发生，届时，红系细胞前体(erythroidprecursors)从主要制造γ-珠蛋白转换成主要制造β-珠蛋白。从主要产生胎儿血红蛋白或HbF(α2γ2)到产生成体血红蛋白或HbA(α2β2)的发育转换起始于妊娠的约28-34周，并在出生后短暂地持续，直至HbA成为主导。这种转换主要是由γ-珠蛋白基因转录的减少以及β-珠蛋白基因转录的增加而引起。尽管在健康成体中的残留HbF水平具有超过20倍的差异并且受到遗传控制，但通常正常成体的血液中含有少于1％的HbF。血红蛋白病(Hemoglobinopathies)涵盖了许多种基因起因的贫血，其中，存在有减少的红血细胞(RBC)产生和/或增加的红血细胞破坏(溶血)。这些血红蛋白病还包括导致伴随有保持氧浓度的能力受损的异常血红蛋白产生的遗传缺陷。一些此类紊乱包括不能产生足够量的正常β-珠蛋白，而另一些紊乱包括完全不能产生正常β-珠蛋白。与β-珠蛋白有关的这些紊乱通常被称作β-血红蛋白病。例如，β-地中海贫血症由(导致有缺陷的HbA或使HbA缺失的)β-珠蛋白基因表达的部分缺陷或完全缺陷造成。镰状细胞贫血由(导致异常(镰状)血红蛋白(HbS)产生的)β-珠蛋白结构基因中的点突变造成。HbS易于聚合，特别是在去氧条件下。HbSRBC比正常RBC更脆弱，并且更容易发生溶血，最终导致贫血。近来，旨在降低患有β-血红蛋白病的患者中的珠蛋白链失衡或易于出现血红蛋白聚合的治疗研究已集中在胎儿血红蛋白(α2γ2；HbF)的药理学操控上。此类方法的治疗潜力由以下结果所暗示：对具有纯合的β-地中海贫血和遗传性胎儿血红蛋白持续存在症(hereditarypersistenceoffetalhemoglobin，HPFH)的共遗传(co-inheritance)的个体的轻度表型的观察结果；以及在胎儿血红蛋白浓度增加的情况下观察到无成体血红蛋白合成并具有纯合的β-地中海贫血的那些患者却具有降低的输血需求。此外，已观察到具有β链异常的成体患者的特定群体的胎儿血红蛋白(HbF)水平高于正常水平，并且已经观察到相比具有正常成体HbF水平的患者，该特定群体具有较轻微的疾病临床过程。例如，表达了20％-30％HbF的沙特阿拉伯镰状细胞贫血患者组仅具有轻微的疾病临床表现。现在认可了血红蛋白紊乱(如镰状细胞贫血和β-地中海贫血)通过增加HbF的产生而得到改善。如前所述，胎儿血红蛋白向成体血红蛋白(α2γ2；HbA)的转换通常在分娩后的六个月内进行。然而，在大多数患有β-血红蛋白病的患者中，上游γ-珠蛋白基因是完整的并且具备完全功能，因此如果使这些基因再活化，则可在成体期维持功能性血红蛋白合成，从而改善疾病严重程度。不幸的是，尚未很好地了解作为珠蛋白转换基础的体内分子机制。支持胎儿血红蛋白产生再活化可行性的证据来自于如下实验：在此类实验中，证明了当给予生长因子的适当组合时，含有克隆源性细胞(clonogeniccells)的外周血产生红系细胞集落(colonies)并在半固体培养中爆发(burst)。此类集落中的各个细胞可累积胎儿血红蛋白(HbF)、成体血红蛋白(HbA)或两者的组合。在来自成体血液的培养物中，有核红细胞仅累积HbA(F-A+)、或HbF和HbA的组合(F+A+)。重要的是，单个集落同时含有F+细胞和F-细胞，这表明这两种类型均为同一循环干细胞的后代。因此，在培养中的发育早期阶段期间，细胞通过目前尚未知晓的机制选择是否表达HbF。在培养中发育的成体F+细胞部分并未出现体内预编程(preprogrammed)，但似乎取决于培养条件：变换到HbF和HbA组合表达通路例如可通过高血清浓度在体外实现，这是由于可被吸附在活性炭上的不明化合物的活性。总体而言，对在珠蛋白转换中起作用的分子的识别对于干扰成体血红蛋白和诱导胎儿血红蛋白合成的新型治疗策略的开发很重要。此类分子将为用于各种血红蛋白病的治疗干预的开发提供新靶标，在这些血红蛋白病中，胎儿血红蛋白合成的再活化将显著改善疾病严重程度和发病率。
技术实现思路
本文提供了通过在基因组水平上破坏BCL11A表达来增加细胞中胎儿β-珠蛋白水平的方法以及组合物。本文还提供了涉及通过胎儿β-珠蛋白水平的再诱导来治疗血红蛋白病的方法以及组合物。本文所述的一个方面涉及用于生产具有减少的BCL11AmRNA或蛋白表达的祖细胞的方法，所述方法包括将分离的祖细胞与药剂进行接触，从而使BCL11AmRNA或蛋白表达降低，所述药剂结合2号染色体的60,716,189-60,728,612位置(根据UCSC基因组浏览器的hg19人类基因组组装)上的所述细胞的基因组DNA。本文所述的另一方面涉及用于生产具有至少一种遗传修饰的基因工程人细胞的方法，所述方法包括将分离的细胞与有效量的组合物进行接触，所述组合物至少包含DNA靶向核酸内切酶或者携带有DNA靶向核酸内切酶的编码序列的载体，其中，所述DNA靶向核酸内切酶在2号染色体的60,716,189-60,728,612位置上对所述细胞的基因组DNA进行切割，从而在其中造成至少一种遗传修饰。在另一方面，本文还提供了在2号染色体的60,716,189-60,728,612位置上具有至少一种遗传修饰的分离的基因工程人细胞。在一个实施方式中，所述至少一种遗传修饰为在基因组DNA中指定位置处的删除。在一个实施方式中，相比在2号染色体的60,716,189-60,728,612位置上没有遗传修饰的对照细胞而言，所述分离的基因工程人细胞具有降低的或减少的BCL11AmRNA或蛋白表达。本文所述的另一方面涉及本文所述的在2号染色体的60,716,189-60,728,612位置上具有至少一种遗传修饰的分离的基因工程人细胞用于增加哺乳动物中胎儿血红蛋白水平的用途。本文所述的另一方面涉及本文所述的在2号染色体的60,716,189-60,728,612位置上具有至少一种遗传修饰的分离的基因工程人细胞用于治疗哺乳动物中的血红蛋白病的用途。本文所述的另一方面涉及本文所述的在2号染色体的60,716,189-60,728,612位置上具有至少一种遗传修饰的分离的基因工程人细胞在制造用于治疗哺乳动物中的血红蛋白病的药物中的用途，由此哺乳动物中的胎儿血红蛋白水平有所增加。本文所述的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于生产具有减少的BCL11A mRNA或蛋白表达的祖细胞的方法，所述方法包括将分离的祖细胞与药剂进行接触，从而使BCL11A的mRNA或蛋白表达降低，所述药剂结合2号染色体的60,716,189‑60,728,612位置(根据UCSC基因组浏览器的hg 19人类基因组组装)上的所述细胞的基因组DNA。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.11.27 US 61/730,323;2012.11.27 US 61/730,369;1.一种用于生产具有减少的BCL11AmRNA和蛋白表达的遗传修饰的人造血祖细胞的方法，所述方法包括离体或在体外向分离的人造血祖细胞中引入编码DNA靶向核酸内切酶的RNA、DNA靶向核酸内切酶或者编码DNA靶向核酸内切酶的载体，其中，所述DNA靶向核酸内切酶结合并切割UCSC基因组浏览器的hg19人类基因组组装的2号染色体的60,716,189-60,728,612位置上的所述人造血祖细胞的基因组DNA，从而在UCSC基因组浏览器的hg19人类基因组组装的2号染色体的60,721,411-60,722,674位置上的DNA酶I超敏感位点+58造成至少一种遗传修饰，从而使所述遗传修饰的人造血祖细胞中的BCL11A的mRNA和蛋白表达降低。2.一种增加遗传修饰的人造血祖细胞中的胎儿血红蛋白水平的方法，所述方法包括以下步骤：离体或在体外向分离的人造血祖细胞中引入编码DNA靶向核酸内切酶的RNA、DNA靶向核酸内切酶或者编码DNA靶向核酸内切酶的载体，其中，所述DNA靶向核酸内切酶结合并切割在UCSC基因组浏览器的hg19人类基因组组装的2号染色体的60,716,189-60,728,612位置上的所述人造血祖细胞的基因组DNA，从而在UCSC基因组浏览器的hg19人类基因组组装的2号染色体的60,721,411-60,722,674位置上的DNA酶I超敏感位点+58造成至少一种遗传修饰，由此所述遗传修饰的人造血祖细胞或其红系后代中的胎儿血红蛋白表达相对于所述引入步骤之前的所述细胞有所增加。3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述人造血祖细胞为红系细胞谱系的细胞。4.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述至少一种遗传修饰为插入。5.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述至少一种遗传修饰为删除。6.如权利要求5所述的方法，其中，所述删除将所述UCSC基因组浏览器的hg19人类基因组组装的2号染色体的60,716,189-60,728,612位置之间的整个区域移除、或者将所述区域的一部分移除，导致所述UCSC基因组浏览器的hg19人类基因组组装的2号染色体的60,721,411-60,722,674位置上的DNA酶I超敏感位点+58的破坏。7.如权利要求5所述的方法，其中，所述删除将所述UCSC...

【专利技术属性】
技术研发人员：斯图尔特·H·奥尔金，丹尼尔·E·鲍尔，徐剑，
申请(专利权)人：儿童医疗中心有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US