一种具有免疫球蛋白结合能力的多肽制造技术

本发明专利技术涉及一种具有免疫球蛋白结合能力的多肽。揭示了一种耐碱性的具有免疫球蛋白结合能力的多肽，其纯化免疫球蛋白的纯化效率高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
；更具体地，本专利技术涉及一种具有免疫球蛋白结合能力 的多肽。
技术介绍
葡萄球菌蛋白A (Protein A)来源于金黄色葡萄球菌（Staphylococcus Aureus)， 为金黄色葡萄球菌表面的一种膜蛋白。Protein A具有与免疫球蛋白特异性结合的能力， Protein A亲和层析柱已成为生物
应用广泛的纯化抗体的亲和柱，可从腹水，血清 和细胞培养上清或细胞抽提物中分离和纯化多种哺乳动物不同亚型的抗体或包含抗体Fc 片段的基因工程重组蛋白。目前，Protein A已经可以通过基因工程重组技术生产。 但是，现有技术中，Protein A还具有不稳定的缺陷，特别是在碱性条件下稳定性 较为不理想，从而影响其应用。因此，本领域还需要进一步开发具有免疫球蛋白结合能力的 蛋白。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有免疫球蛋白结合能力的多肽。 在本专利技术的第一方面，提供一种具有免疫球蛋白结合能力的多肽，所述的多肽具 有以下式⑴结构： (Y-X)n-Y-Z (I) 其中，Y为氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的多肽； X为连接肽； Z为无或半胱氨酸； η为1-20的正整数。 在一个优选例中，所述的免疫球蛋白是IgG ;更特别地为人IgG。 在另一优选例中，所述的具有免疫球蛋白结合能力的多肽在碱性pH值下具有化 学稳定性。 在另一优选例中，所述的连接肽的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示；或 η为2-10的正整数（更佳地，η为3-7的正整数；进一步更佳地，η为3-4的正整 数）；或 Z为半胱氨酸时，半胱氨酸的数量为1-5个；较佳地2-3个；较佳地，应用半胱氨酸 的巯基将蛋白定向偶联在介质上。 在另一优选例中，所述的多肽具有SEQ ID Ν0:3所示的氨基酸序列。 在本专利技术的另一方面，提供一种变异型葡萄球菌蛋白A结构域，所述的结构域的 氨基酸序列如SEQ ID Ν0:2所示的多肽。 在本专利技术的另一方面，提供分离的多核苷酸，其编码前面任一所述的多肽或所述 的变异型葡萄球菌蛋白A结构域。 在本专利技术的另一方面，提供一种表达载体，其包含一多核苷酸，该多核苷酸编码前 面任一所述的多肽。 在本专利技术的另一方面，提供一种宿主细胞，所述的宿主细胞包含所述的表达载体； 或其基因组中整合有一多核苷酸，该多核苷酸编码前面任一所述的多肽。 在本专利技术的另一方面，提供一种生产所述的具有免疫球蛋白结合能力的多肽的方 法，包括步骤： (1)培养所述的宿主细胞，获得培养物；和 (2)从培养物中分离所述的具有免疫球蛋白结合能力的多肽。 在另一优选例中，所述的宿主细胞是大肠杆菌细胞。 在本专利技术的另一方面，提供前面任一所述的具有免疫球蛋白结合能力的多肽的用 途，用于结合免疫球蛋白；或用于制备免疫球蛋白亲和介质或亲和柱；或用于免疫球蛋白 的纯化。 在本专利技术的另一方面，提供一种纯化免疫球蛋白的亲和柱，其包括亲和介质，以及 附着于所述亲和介质的所述的具有免疫球蛋白结合能力的多肽。 在另一优选例中，所述的亲和介质包括但不限于：琼脂糖（珠），葡聚糖凝胶、纤维 素、大孔吸附树脂/胶体金或者合成的微球等。 本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。【附图说明】 图1、完整的天然葡萄球菌蛋白A序列SEQ ID NO: 5 (蛋白序列Genbank登录号： AAA26677. 1，核酸序列Genbank登录号：M18264. 1)，氨基酸上端的线标记处EDABC的结构 域。 图2、天然葡萄球菌蛋白A(SPA)的EDABC结构域以及融合蛋白Y结构域的氨基酸 序列比对。 图3、实施例所述的在插入载体Y(G26A)四聚体-CC之后的质粒pET28-Y4的质粒 图谱。 图4、融合蛋白Y四聚体的表达鉴定12%SDS-PAGE电泳。条带1，2,3为诱导前，条 带4, 5,6为对应的诱导后。 图5、耐碱性实验；在位清洗条件：0. 5M NaOH，每1个循环接触时间为lOmin，每20 个循环测定一次结合能力；绘制亲和柱的相对结合能力与碱处理循环次数变化曲线。 图6、SDS-PAGE检测亲和柱经多次使用并在位碱处理循环次数后纯化样品的纯 度。 条带1.蛋白Marker ;2.上样液，稀释的免疫小鼠腹水；3.穿出液；4.第4轮处理 后上样洗脱后样品；5.第21轮；6.第39轮；7.第57轮；8.第75轮；9.蛋白Marker ; 10.第 95 轮；IL 第 111 轮；12.第 129 轮；13.第 148 轮； 图7、亲和柱的相对结合能力与亲和柱使用次数即在位碱处理循环次数变化曲线。 图8、SDS-PAGE检测亲和柱纯化人血清IgG 条带1.蛋白Marker ;2.上样液,稀释的人血清；3.穿出液；4.洗脱后样品； 图9、亲和柱从细胞培养液中纯化Fe融合蛋白洗脱曲线。 图10、还原SDS-PAGE检测亲和柱从细胞培养液中纯化Fe融合蛋白，上样量： 6 μ g〇 条带1.上样液，细胞培养后的上清液；2.穿出液；3.洗脱后样品；Μ.蛋白Marker。 图11、ELISA方法测定宿主CHO细胞蛋白HCP的标准曲线。【具体实施方式】 本专利技术人经过广泛而深入的研究，首次揭示一种高稳定性的具有免疫球蛋白结合 能力的多肽，与Protein A相比，该多肽的稳定性大大提高，具有更强的免疫球蛋白结合能 力，纯化效率高。在此基础上完成了本专利技术。 本专利技术提供了一种在Protein A的Y结构域基础上进行突变后获得的变异型 Protein A结构域。该变异型结构域的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示，相对于原Y结构域 (SEQ ID NO: 1)，其在氨基酸第26位发生G -A的突变。该变异型结构域的重复结构具有 免疫球蛋白结合能力。 本专利技术还提供了具有免疫球蛋白结合能力的所述变异型结构域的重复结构，其是 具有式⑴结构的多肽。 所述的变异型Protein A结构域一般通过多肽连接子（连接肽）连接以制备重复 结构。作为本专利技术的一种优选的方式，所述的变异型结构域通过多肽连接子（连接肽）连 接，从而形成重复结构。所述的连接子包括1-20个氨基酸；较佳地为5-15个氨基酸，更佳 地为8-12个氨基酸，如10个，只要该连接肽不影响重复结构的空间折叠方式且不影响重复 结构对于免疫球蛋白的结合活性，则均可应用于本专利技术。较佳地，所述的连接肽也具有耐碱 性。作为本专利技术的优选方式，所述的连接肽是氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示的连接肽。 此外，可选择地，所述的具有免疫球蛋白结合能力的氨基端或羧基端还可含有一 个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本专利技术。例如，所述的标签 可以是6-His，FLAG，HA，HA1，c-Myc等。这些标签可用于对该多肽进行分离纯化。一个具 体的例子是多肽的N末端连接有6-His结构。本领域人员应理解，可以在蛋白标签氨基酸 序列与本专利技术多肽的氨基酸序列之间设置可酶切结构，从而可将标签从融合蛋白上分离。 作为本专利技术的优选方式，所述的具有免疫球蛋白结合能力的羧基端或氨基端设置 可与亲和介质相连接的结构。例如，可设置一或多个半胱氨酸，以将蛋白定向偶联在亲和介 质上，与环氧类或本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有免疫球蛋白结合能力的多肽，其特征在于，所述的多肽具有以下式(I)结构：(Y‑X)n‑Y‑Z  (I)其中，Y为氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的多肽；X为连接肽；Z为无或半胱氨酸；n为1‑20的正整数。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵致，安少朋，
申请(专利权)人：迈格生物医药上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31