自养培养制造技术

本发明专利技术涉及包括以下方法步骤的方法：A)在自养条件下在培养基中繁殖细胞直到X个细胞/升的细胞密度，所述细胞已如此进行了遗传修饰，以至于它们具有与它们的野生型相比减少的聚羟基烷酸酯合成，B)在培养基中将所述细胞的至少一部分稀释至0.001 X至0.5 X、优选0.01 X至0.3 X、特别优选0.05 X至0.2 X的细胞密度，和C)在自养条件下繁殖所述细胞的至少一部分。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及包括细胞的自养培养的方法。
技术介绍
在发酵制备产物的情况中，总是努力尽可能避免不希望的副产物的形成或使其减 少至最小。通常，可以由此增加产物收率，并且也可以简化终产物的纯化。 使用无机碳作为碳源以合成有机分子的细胞尤其以爆鸣气细菌和产乙酸生物的 形式已知。 产生聚羟基烷酸酯的生物使用3-羟基烷酰基（alkanyl)-辅酶A作为前体。该代 谢产物可以充当出色的起始物质，以尤其也通过人工插入的代谢途径代谢成另外的高价值 的有机物质。 具体地，近年来已经详细表征和研宄了爆鸣气细菌钩虫贪铜菌（Opriahdks necator\ 在 NoWhrechX 等k, Excretion of Metabolites by Hydrogen Bacteria L Autotrophic and Heterotrophic Fermentations, European J. AppI. Microbiol. Biotechnol. 6，145-155 (1978)中，分析了不同钩虫贪铜菌菌株的副产物形成。 本专利技术的目的是，提供一种在发酵法中减少副产物形成并从而增加在生物合成中 减少的聚羟基烷酸酯的单体单元的收率的方法。
技术实现思路
已经令人惊奇地发现，在下文中描述的方法能够达到所述的目的。 因此，本专利技术提供了一种方法，其中已经在自养条件下进行特别用于产生细胞团 的预培养，继之以进一步的自养培养，其优选至少经过培养的部分时间范围用于产物形成。 本专利技术的一个优点在于，明显减少形成不希望的副产物，例如乙酸盐、乳酸盐、丙 酮酸盐、琥珀酸盐、丙氨酸、缬氨酸、丁醇、丁酸盐、苹果酸盐、丙酮、2-甲基丙酸或3-甲基丁 酸盐，特别是乙酸盐、丙酮酸盐和丙酮。 因此，本专利技术有利地增加空间-时间收率。 本专利技术的另一个优点是，可以更容易地分离期望的产物。 本专利技术的另一个优点是，可以完全独立于复杂的碳源(例如，糖）来进行。 本专利技术的另一个优点是，二氧化碳被结合，否则其可作为温室气体而产生问题。 根据本专利技术的方法包括以下方法步骤： A) 在自养条件下在培养基中繁殖细胞直到X个细胞/升的细胞密度，所述细胞已如此 进行了遗传修饰，以至于它们具有与它们的野生型相比减少的聚羟基烷酸酯合成， B) 在培养基中将所述细胞的至少一部分稀释至0.001 X至0.5 X、优选0.01 X至0.3 X、特别优选〇. I X至〇. 2 X的细胞密度，和 C) 在自养条件下繁殖所述细胞的至少一部分。 在本专利技术上下文中的术语"在自养条件下"应当被理解为是指这样的培养条件：其 中基于碳原子计，细胞可利用的碳源含有至少90重量％的无机碳。 细胞的"野生型"优选表示这样的细胞：其基因组以天然方式通过进化产生的状态 存在。该术语用于全细胞和单个基因。因此，术语"野生型"特别地不包括这样的细胞或基 因：其基因序列已经借助于重组技术至少部分地被人工修饰。 在本专利技术上下文中的术语"与野生型相比减少的聚羟基烷酸酯合成"应当被理解 为是指，当在与野生型相同的条件下培养时，所研宄的细胞每个细胞形成与野生型相比更 少的聚羟基烷酸酯。 除非另有说明，给出的百分比（%)是质量百分比。 在根据本专利技术的方法中使用的细胞是遗传修饰的细胞，因此是重组细胞。它们可 以是原核生物或真核生物。它们可以是哺乳动物细胞（诸如人细胞）、植物细胞或微生物诸 如酵母、真菌或细菌，其中微生物是特别优选的，且细菌和酵母是最优选的。根据本专利技术优 选的是，使用的细胞选自产乙酸细菌或爆鸣气细菌。 术语"爆鸣气细菌"应当被理解为是指这样的细菌：其能够化能自养生长，且能够 在氧存在下由4和CO 2构建具有超过一个碳原子的碳骨架，其中氢被氧化且氧被用作末端 电子受体。根据本专利技术，可使用这样的细菌，其天生就是爆鸣气细菌或者已经通过遗传修 饰变成爆鸣气细菌的细菌，例如通过必要酶的重组插入，已经能够在氧存在下由托和CO 2 构建具有超过一个碳原子的碳骨架的大肠杆菌细胞，其中氢被氧化且氧被用作末端电子受 体。优选地，在根据本专利技术的方法中使用的爆鸣气细菌是作为野生型已经是爆鸣气细菌的 那些。 根据本专利技术优选使用的爆鸣气细菌选自以下属：无色杆菌属（ 酸硫杆菌属（Jcii/iiAioAaciBiAs)、食酸菌属（Jcit/orarar)、产喊菌属太 湖念珠藻属产液菌属（如wi/kr)、节杆菌属（AriAroAacier)、 固氮螺菌属（如J7腫)、芽孢杆菌属（ifeciJ7w5·)、慢生根瘤菌属（腫)、 贪铜菌属（Copria 、德克斯氏菌属（ifem'a)、螺杆菌属（Zfe/icoAac ier)、草螺菌 HerbaspiriIhmi)、篆 H 魯·}{Hydrogenobacter)、Hydrogenobaculum、後篆魯·} (Hydrogenophaga) > liSIMl M (Hydrogenophilus) > Hydrogeno thermus^ Hydrogenovibri 艾德昂菌属 ft/种（5/7. ft/)、生金球菌属分 枝杆菌属（IcoAac ieria?)、诺卡氏菌属（Abcart/ia)、寡养菌属（ft/igo 、副球菌 属（Zkracoccw1S)、/Waroffioflas、假单胞菌属（、假诺卡氏菌 属根瘤菌属（TPAizoAitt?)、红球菌属（TPAoi/ococciAs)、红假单胞菌 属红螺菌属（7?A〇￡/〇577iri77tt?)、塞里伯氏菌属（5Wi/?6?ria)、链 霉菌属（5·^Γ<9/7?ο?_7??(95·)、荚硫菌属（TXioca^a)、贪菌属（Kariorarar)、黄色杆菌属 (ZafliAoAacier)、沃特氏菌属（Fawiersia),其^ 7贪铜菌属是特别优选的， 特别选自以下种：钩虫贪铜菌（/?ecaior)(别名富养罗尔斯通氏菌 {Ralstonia eutropha)^ Wautersia eutropha^ IMl {Alcaligenes eutrophus).、 氧赛篆单觀售^ Hydrogenomonas eutrophaY)、Achromobacter ruhlandii、氧 W 舊Λ% 後 硫杆菌（Jcii/i (AioAaciBw1S /krroiorii/afls)、敏捷食酸菌（Jcit/o rarar 、嗜氢 Zfe IMl {Alcaligenes hydrogenophilus)^ IMl {Alcaligenes latus)^ Anabena cylindrica.、Anabena osciIlaroides.、欠概念3%嚴MilAnabena sp·、.、Anabena spiroides.、 Ancyclobacter vacuolatus^ Aquifex aeoli cus^ jJi f11'MM (A qui fex pyrophi lus)^^\i 杆菌属 77讀[株（AriAroAac ier 5· irai/? 77Z)、施氏芽抱杆菌（、大 豆慢生根瘤菌办rAizoAia? j'a/70/?ic腫)、胶德克斯氏菌（ifem'a 麵osa)、大肠杆菌 (」&cA本文档来自技高网...

【技术保护点】
包括以下方法步骤的方法：A) 在自养条件下在培养基中繁殖细胞直到X个细胞/升的细胞密度，所述细胞已如此进行了遗传修饰，以至于它们具有与它们的野生型相比减少的聚羟基烷酸酯合成，B) 在培养基中将所述细胞的至少一部分稀释至0.001 X至0.5 X、优选0.01 X至0.3 X、特别优选0.05 X至0.2 X的细胞密度，和C) 在自养条件下繁殖所述细胞的至少一部分。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：T哈斯，M珀特，M德姆勒，EM埃克尔，S贝克，
申请(专利权)人：赢创德固赛有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE