本发明专利技术目的是提供一种产低温碱性蛋白酶的菌株，为芽孢杆菌(Bacillus sp.)WFWBac-1，于2015年4月9日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.10703。本发明专利技术筛选的菌株用于发酵生产碱性蛋白酶。本发明专利技术筛选的菌株性状优良、产蛋白酶活力高；该菌株在以蔗糖为碳源，蛋白胨为氮源，培养基初始pH9.0，培养温度25℃，接种量为10％的条件下150rpm振荡培养48h时，所产蛋白酶活性最高能达到995U/mL。所制备的酶用于制备洗衣液或洗洁精。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于功能微生物筛选
，具体涉及一种产低温碱性蛋白酶的菌株。
技术介绍
蛋白酶是非常重要的一种水解酶，国内外相关数据显示，在所有的工业酶制剂中， 蛋白酶占据了 75%，是工业用酶比例最大的，销售额约占世界年销售总额的百分之60%左 右。而碱性蛋白酶是世界工业酶制剂中最重要的酶制剂之一，其用途非常广泛，受到了大家 的广泛关注。目前，碱性蛋白酶主要应用在洗涤和皮革行业中，其中在洗涤剂中，99%以上 的都或多或少地加入各种蛋白酶，导致了如今供不应求的需求关系。目前作为洗涤剂添加 剂的碱性蛋白酶多为中温蛋白酶，最适反应温度通常在50-70°C，但在发展中国家，洗涤剂 通常在室温25°C左右使用，因此添加到洗涤剂中的碱性蛋白酶的催化效率不高，许多研宄 者开始着手低温碱性蛋白酶的研宄。但目前还没有实际应用的产低温碱性蛋白的菌株。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种产低温碱性蛋白酶的菌株，从而弥补现有技术不足。 本专利技术的产低温碱性蛋白酶的菌株，为芽孢杆菌（Bacillus sp. )WFWBac-l，于 2015年4月9日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研宄所 的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 10703。 本专利技术筛选的菌株用于发酵生产碱性蛋白酶； 本专利技术还提供一种代谢生产碱性蛋白酶的方法，是以蔗糖为碳源，蛋白胨为氮源， 初始pH为9. 0的培养基中接种筛选的菌株，培养温度25°C，振荡培养48h ; 其中菌株的接种量优选为10%。 本专利技术菌株生产的碱性蛋白酶，最适作用温度为20°C，最适作用pH为9. 0，Μη2+对 该酶有较强的激活作用，Zn2+，EDTA和PMSF对该酶具有一定的抑制作用。 本专利技术筛选的菌株性状优良、产蛋白酶活力高；该菌株在以蔗糖为碳源，蛋白胨为 氮源，培养基初始pH 9. 0,培养温度25°C，接种量为10%的条件下150rpm振荡培养48h时， 所产蛋白酶活性最高能达到995U/mL。【附图说明】 图1 :碳源对菌株的发酵酶活的影响图， 图2:氮源对菌株的发酵酶活的影响图， 图3 :发酵时间对WFWBac-I菌株产酶的影响图， 图4 :发酵温度对WFWBac-I菌株产酶的影响图， 图5 :培养基起始pH值对WFWBac-I菌株产酶影响图， 图6 :接种量对WFWBac-I菌株产酶的影响图， 图7 :温度对酶活的影响图。【具体实施方式】 本专利技术所使用的培养基的信息如下： LB营养琼脂培养基：牛肉膏5g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂粉20g、海水lOOOmL，在 121°C下高压灭菌15min。 酪蛋白培养基：酪蛋白 10g、蛋白胨 5g、酵母 2. 5g、KH2PO4O. 3g、MgSO4 · 7H200. 5g、 NaCl lg、琼脂粉20g、海水1000mL，在121°C下高压灭菌15min。 LB液体培养基：牛肉膏5g，蛋白胨5g，陈海水lOOOmL。 蛋白酶活力测定方法采用Folin-酷法测定蛋白酶的活力。酶活定义：lmL酶液在 一定PH值和温度下，每分钟水解酪蛋白产生I μ g酪氨酸的酶量为1个酶活力单位（U/mL)。 计算公式如下： 蛋白酶活力（U/mL) = (AXNX4)/10 式中：A--由样品测得OD值，查标准曲线得相当的酪氨酸微克数； 4--4毫升反应液取出ImL测定（即4倍）； N--酶液稀释的倍数； 10--反应 10min。 下面结合实施例对本专利技术进行详细的描述。 实施例1 :菌株的筛选及鉴定 从青岛海域收集的裙带菜中进行内生细菌的分离，并将得到的单菌落点种于酪蛋 白培养基上，观察各菌株产透明圈情况，进行菌种的初筛；然后将产透明圈的菌株接种于液 体发酵培养基上，于25°C摇瓶培养3d，在4°C，10000r/min条件下离心15min，取上清液，测 定其蛋白酶活力，筛选出产蛋白酶活力最高的菌株。 参照《伯杰细菌鉴定手册》和《系统鉴定》，依据其生理生化特征对WFWBac-I菌株 进行分类鉴定。 对WFWBac-I菌株进行生理生化鉴定试验，结果如表1所示，参照《伯杰细菌鉴定手 册》和《细菌系统鉴定手册》，鉴定结果显示：WFWBac-I菌株能水解酪蛋白，明胶，淀粉，使硝 酸盐还原，鉴定该菌为革兰氏阳性菌。 表1生理生化鉴定结果 注：" + "表示反应为阳性：表示反应为阴性。 并进行16S rDNA序列分析，具体步骤如下： (1)基因组的DNA提取 制备基因组DNA时，首先根据细菌是革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌，对革兰氏 阴性菌，先用Digestion Buffer，后用Proteinase K裂解细菌，对于革兰氏阳性菌，先用溶 菌酶驱除细胞壁，后用Proteinase K和去污剂裂解细菌，释放出基因组DNA。 (2) PCR 反应 ① PCR 体系建立（50 μ L): ②PCR程序设定 预变性 94°C 4min ;循环 94°C 45s，55°C 45s，72 °C lmin，30 个循环；修复延伸 72 °C 8min ； ③引物序列： 7F 5, CAGAGTTTGATCCTGGCT 3, 18bp 1540R 5, AGGAGGTGATCCAGCCGCA 3, 19bp (3) DNA琼脂糖切胶纯化 用DNA胶回收试剂盒回收目的片段，并用电泳检测纯化后DNA的纯度和含量。 (4)目的片断的TA克隆和筛选 以pEASY-Tl为载体进行TA连接，目的片段与载体的比例为8:1。于42°C下转化到 E. coli 110菌株。最后涂布于含有氨苄青霉素的LB平板中。通过蓝白斑筛选和菌落PCR 鉴定阳性克隆。 (5)质粒DNA提取 参照TransGen公司的质粒提取试剂盒进行质粒提取。 (6) DNA 测序 由上海生工生物工程技术服务有限公司将提取的质粒DNA，进行测序。 (7)系统进化树的构建及分析 从NCBI的基因库中寻找与WFWBac-I的16S rDNA相关的序列，将相关性最高的菌 株同WFWBac-I菌株一同构建系统进化树，并进行同源性比较，进而确定菌株的分类。鉴定 WFWBac-I为芽孢杆菌目，芽孢杆菌科，芽孢杆菌属，命名为Bacillus sp. WFWBac-I。 实施例2菌株的发酵条件优化 1、碳源对WFWBac-I细菌产酶的影响 在液体培养基中分别用待测碳源（葡萄糖，蔗糖，淀粉，果糖，乳糖）为唯一碳源， 25°C、150r/min培养48h后测定蛋白酶活。结果如图1所示，蔗糖作为碳源时，WFWBac-I菌 株的酶活最高，葡萄糖、乳糖、淀粉较低，果糖最低。可见，该菌株能充分利用蔗糖中的碳源 进行生长代谢繁殖，所以，蔗糖为WFWBac-I的最佳碳源。 2、氮源对WFWBac-I细菌产酶的影当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种菌株，其特征在于，所述的菌株的保藏编号为CGMCC NO.10703。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王凤舞，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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