本发明专利技术公开了一种金华猪乳腺上皮细胞系的培养方法。利用金华猪泌乳期21天乳腺组织进行原代培养、传代培养最终获得高纯度、高活率的金华猪乳腺上皮细胞系，此乳腺细胞系属于生物学领域。培养得到的乳腺细胞系不含成纤维细胞等杂细胞，细胞纯度高；冻存细胞质量稳定，经过细胞冻存复苏后活率可达90%，细胞传代后生长稳定，适合大规模培养。经过细胞学特性的检测，表明该细胞系符合细胞系建系要求。本发明专利技术涉及的金华猪乳腺上皮细胞可以用于制作转基因猪的核移植供体；可以为医学及分子生物学研究提供原材料；农业上可以丰富和改良地方猪种，是我国地方优良猪种的有效保护手段。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞生物学领域，尤其涉及。
技术介绍
畜禽遗传资源保护问题最早于50年代在美国提出。自1972年斯德哥尔摩人类环境会议以后，引起联合国粮农组织(FAO)与环境规划署(UNEP)的重视，他们联手在全球开展了家养动物遗传资源的保护行动，至今前后进行了几十年的工作，取得了明显的成效。我国从开始就参加了他们组织的一系列计划与行动。但目前中国的畜禽遗传资源保护形势并不乐观。在80年代进行的普查中，估计共有品种600个，其中本国地方品种有385个。有10个地方品种已经灭绝，8个品种濒临灭绝。20个品种的有效群体含量急剧下降，占调查品种数364个的13%。又据中国农科院畜牧所与全国畜牧兽医总站种畜禽处在2000年完成的“畜禽遗传资源多样性补充调查”的资料称，在调查的17个省区的331个品种中，处于濒危与将要灭绝的品种有59个，占调查总数的18%另有7个品种已经灭绝，例如云南的大普吉猪，浙江的萧山鸡、文山鹅、思茅鹅、草海鹅等。我国畜禽遗传资源丰富，它们在畜牧生产和新遗传资源形成过程中发挥了非常重要的作用。近20年来，为满足人民对肉、蛋、奶、蜜等畜产品的需求，我国相继引进了大量的外来高产品种对低产地方品种进行改良，使畜牧生产水平大幅提高。但改良的消极后果使某些地方品种逐渐被培育品种或杂交种所取代，致使具有丰富多样性的地方品种群体数量下降或消失。最近研宄表明，50%以上地方畜禽品种的群体数量处于不同程度的下降，其中一定数量处于濒危状态。国内外多年来保种工作的实践与经验，告诉我们要有效保护地方优良的畜禽资源关键是要采用经济合理的方法，即使得畜禽资源得到很好的保护又要节约成本。这里应用细胞生物学方法建立畜禽的细胞系就是一个有效经济的方法。在建立细胞系的过程中同时对此细胞的基本生物学特性进行研宄，为以后进一步的研宄提供技术与理论支持。金华猪是中国著名的地方品种。又称两头乌，产于浙江东阳、义乌、金华等地。据金华县古方出土的西晋(公元265-316年)陶猪和陶猪圈考证，早在1600年前这一带的养猪业已相当发达。相传在古代就有“家乡肉”的腌制品，尔后演变成火腿。随着火腿远销，金华猪也随之扬名。金华猪体型中等，耳下垂，颈短粗，背微凹，臀倾斜、蹄质坚实。全身被毛中间白，头颈、臀尾黑。以早熟易肥、皮薄骨细、肉质优良、适于腌制火腿著称。7?8月龄、体重70?75千克时为屠宰适期，胴体瘦肉率40%?45%。目前，由于外来猪种的大量引进和一些社会因素的干扰使得金华猪的种群数量持续减少，肉品质持续下降，应该采取有效措施加强金华猪的保种。细胞生物学研宄一直都很受人们的重视，随着科学研宄的发展，人们对细胞的研宄也越来越深入，细胞生物学的发展为其它生命科学的发展提供了研宄基础，也可以说细胞生物学是其它生命学科发展的前提。这也从另一个侧面反映出畜禽资源细胞保存的重要性。这些种质资源一旦失去就无法再进行研宄与应用，所以很多国家目前都致力于种质资源的保存。我国保护物种多样性方面也面临着许多问题需要解决。哺乳动物核移植技术的发展也日趋完善，细胞核移植技术是将供体细胞核移入出去核的卵母细胞中，使后者不经过精子穿透等有性过程即无性繁殖即可被激活、分裂并发育成新个体，使得核供体的基因得到完全复制。它在动物育种、制备转基因动物、基因治疗及器官移植等方面具有重大的作用，而成纤维细胞是核移植中的一种理想的供体细胞。金华猪作为一个优良的地方猪种，它在育种方面具有巨大的潜力，而且猪也是一种人类器官的比较优良的提供者，因而金华猪乳腺上皮细胞的建系具有重要的科研与生产价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供。为实现上述目的，本专利技术采取以下技术方案: 金华猪乳腺上皮细胞系的培养方的步骤如下: O原代培养:从泌乳21天金华猪乳腺中剪取乳腺样品，用含有青霉素和链霉素的PBS清洗样品3~4次，然后剪成0.5-1.0mm3的组织块；将组织块移入50ml离心管中，加入等比例的胰蛋白酶和胶原酶IV混合消化液消化乳腺组织两小时，将消化液过滤于100目细胞筛，收集过滤液，并转移至15ml高压灭菌离心管中100rpm离心细胞5min，倒掉消化液，留取底部的细胞团，用PBS洗三次，加入5ml包含体积分数为10%的胎牛血清的DMEM培养液，吹打细胞团使之均匀悬浮，最后放入37°C以及体积百分数为5%0)2的培养箱中培养；待细胞长出后，观察细胞生长情况，利用成纤维细胞和乳腺上皮细胞对胰蛋白酶的敏感性不同，对乳腺上皮细胞进行纯化； 2)传代培养:倒出步骤I)过程中的培养液，用PBS清洗2~3次后，用体积分数为0.25%的胰蛋白酶消化细胞后加入10~15ml的培养液终止消化；消化后的细胞平均分成三瓶，放入37°C，5%0)2的培养箱中培养； 3)细胞冻存: (1)准备冻存前24~26h弃除原有培养液并更换新的培养液10~15ml，继续培养24~26h; (2)倒出培养瓶中的培养液，用PBS清洗2~3次后，用胰蛋白酶消化后加入10~15ml的培养液终止消化； (3)100rpm离心细胞5min，去上清，加入1-1.5ml的冻存液，吹打细胞使其悬浮；冻存液成分:体积百分数为50%胎牛血清、体积百分数为40%DMEM及体积百分数为10%DMS0 ； (4)将细胞及冻存液转移到冻存管中，用封口膜封口； (5)将装有细胞的冻存管转移到4°C冰箱中放置l~2h，然后转入-20°C冰箱中放置2~3h，再移入到-70°C的冰箱中过夜，最后快速将其移入到液氮中长期保存，并做好相应的记录; 4)细胞复苏 (1)将冻存管从液氮中取出后迅速放入37~39°C水浴锅中融化，晃动l~2min; (2)把细胞移入到加入了10~15ml全培养基离心管中，1000r/min离心5min; (3)去上清，加入2ml的培养基，将细胞轻轻吹打均匀后将细胞移入有培养液的培养瓶，放置于37 °C，5%C02的培养箱中培养。所述步骤2)的胰蛋白酶消化的步骤为:向培养瓶中加入37~39°C预热的质量百分数为0.25%的胰蛋白酶1.5~2ml，在显微镜下观察体积百分数为90%的细胞变成圆形后将胰蛋白酶倒掉，用手拍打细胞培养瓶，使细胞脱落，加入10~15ml新的培养液。所述的步骤3)中的细胞冻存的步骤为:弃除原有培养液并更换新的培养液继续培养24~26h ;用PBS清洗2~3次后，用胰蛋白酶消化后加入10~15ml的培养液终止消化；100rpm离心细胞5min，去上清，加入1~1.5ml的冻存液，吹打细胞使其悬浮；将细胞及冻存液转移到冻存管中，用封口膜封口 ；将装有细胞的冻存管转移到4°C冰箱中放置l~2h，然后转入_20°C冰箱中放置2~3h，再移入到_70°C的冰箱中过夜，最后快速将其移入到液氮中长期保存。 所述的步骤4)中的细胞复苏的步骤为:将冻存管从液氮中取出后迅速放入37~39°C水浴锅中融化，晃动l~2min后，把细胞移入到加入了 10~15ml全培养基离心管中，1000r/min离心5min后去上清，加入2ml的培养基，将细胞轻轻吹打均匀后将细胞移入有培养液的培养瓶，放置于37 °C，5%C02的培养箱中培养。本专利技术对于酶消化法培养方法及培养基培养液成分的改进调整，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种金华猪乳腺上皮细胞系的培养方法，其特性在于它的步骤如下：1）原代培养从泌乳21天金华猪乳腺中剪取乳腺样品，用含有青霉素和链霉素的PBS清洗样品3~4次，然后剪成0.5~1.0mm3的组织块；将组织块移入50ml离心管中，加入等比例的胰蛋白酶和胶原酶Ⅳ混合消化液消化乳腺组织两小时，将消化液过滤于100目细胞筛，收集过滤液，并转移至15ml高压灭菌离心管中 1000rpm离心细胞5min，倒掉消化液，留取底部的细胞团，用PBS洗三次，加入5ml包含体积分数为10%的胎牛血清的DMEM培养液，吹打细胞团使之均匀悬浮，最后放入37℃以及体积百分数为5%CO2的培养箱中培养；待细胞长出后，观察细胞生长情况，利用成纤维细胞和乳腺上皮细胞对胰蛋白酶的敏感性不同，对乳腺上皮细胞进行纯化；2）传代培养倒出步骤1）过程中的培养液，用PBS清洗2~3次后，用体积分数为0.25%的胰蛋白酶消化细胞后加入10~15ml的培养液终止消化；消化后的细胞平均分成三瓶，放入37℃，5%CO2的培养箱中培养；3）细胞冻存（1）准备冻存前24~26h弃除原有培养液并更换新的培养液10~15ml，继续培养24~26h;（2）倒出培养瓶中的培养液，用PBS清洗2~3次后，用胰蛋白酶消化后加入10~15ml的培养液终止消化；（3）1000rpm离心细胞5min，去上清，加入1~1.5ml的冻存液，吹打细胞使其悬浮; 冻存液成分：体积百分数为50%胎牛血清、体积百分数为40%DMEM及体积百分数为10%DMSO；（4）将细胞及冻存液转移到冻存管中，用封口膜封口； (5)将装有细胞的冻存管转移到4℃冰箱中放置1~2h，然后转入‑20℃冰箱中放置2~3h，再移入到‑70℃的冰箱中过夜，最后快速将其移入到液氮中长期保存，并做好相应的记录;4）细胞复苏(1) 将冻存管从液氮中取出后迅速放入37~39℃水浴锅中融化，晃动1~2min;(2) 把细胞移入到加入了10~15ml 全培养基离心管中，1000r/min离心5min;(3) 去上清，加入2ml的培养基，将细胞轻轻吹打均匀后将细胞移入有培养液的培养瓶，放置于37℃，5%CO2的培养箱中培养。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：彭静，徐宁迎，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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