蒺藜内生菌中普鲁兰酶活性菌株及其培养方法技术

本发明专利技术提供了一种蒺藜内生菌中普鲁兰酶活性菌株，该菌株是肠杆菌(Enterobacter sp.)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2015071。同时，本发明专利技术公开了该菌株的培养方法，通过富集培养、分离培养以及复筛等步骤得到该菌株。本发明专利技术以蒺藜为材料，在富集培养基中通过合理调整各组分含量，有利于弱势菌株的存活与培养；通过DNS法，对该菌株的普鲁兰酶活性测定表明，该菌株具有较高的普鲁兰酶活性，在30℃、180r/min、pH6.0条件下发酵培养56h，产酶量可达4.19U/mL，可作为良好的诱变出发菌株和构建工程菌的普鲁兰酶基因备选菌株。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物培养领域，具体涉及一种蒺藜内生菌中具有普鲁兰酶活性的菌株及其培养方法。
技术介绍
蔡藜Tribulus terrestris L.为一年生草本植物，全国各地均有分布，其鲜嫩营养器官可做牲畜饲料，果实则可入药，具有治疗头痛眩晕、胸胁胀痛、乳闭乳痈、目赤翳障、风瘆瘙痒之功效。植物内生菌是重要的微生物遗传资源组成部分，因特殊的寄生或腐生环境，往往具有与土壤微生物不同的生理特性。关于传统药用植物蒺藜的内生菌研宄尚未见报道。普鲁兰酶产生菌一直是微生物功能酶中的研宄热点之一。普鲁兰酶是一种能够专性水解α -1，6糖苷键的脱支酶，既是支链淀粉降解不可或缺的关键酶，也是洗涤工业的一种常见添加剂。截至目前，世界范围内普鲁兰酶商品的绝大部分市场份额仍然是由丹麦NOVO公司所占有。国内外也有不少关于普鲁兰酶产生菌的报道，但绝大多数野生菌株活性较低，即使是通过基因工程技术构建的工程菌株，也往往难以达到理想的发酵效果，酶活性稳定性较差。自然界的微生物资源极其丰富，被人们培养、鉴定和开发利用的仅占极少部分，所以，通过试验材料、试验方法、培养基创新等研宄手段的改进，不断的筛选和积累产功能酶菌株仍然是一项长期而艰巨的研宄工作。目前，各类文献报道的普鲁兰酶产生菌的筛选及鉴定方法大同小异，主要技术环节如下:筛选普鲁兰酶产生菌常用的样品类型主要有:常规大田土壤、河水、海水、河底和海底淤泥、淀粉厂区土壤等。筛选普鲁兰酶产生菌最常见的分离培养基配方是:糯米淀粉25g，蛋白胨5g，酵母膏 5g，KH2PO40.5g，K2HPO40.5g，MgSO4.7H20 0.lg，琼脂粉 20g，加水溶解后定容至 1000mL，pH值为6.0ο普鲁兰酶产生菌鉴别培养基配方是:蛋白胨10g，酵母膏2g，红色普鲁兰糖3g，NaCl 2g，琼脂20g，加水溶解后定容至lOOOmL，pH值为7.0。普鲁兰酶活性的测定最常用的方法是3，5- 二硝基水杨酸法(DNS法)。普鲁兰酶产生菌系统菌鉴定的方法主要包括菌体(菌落)形态、生理生化指标的测定和16S rDNA序列分析。试验操作的一般技术流程是:米集试验样品富集培养初筛分尚培养鉴别分离培养(复筛)一一普鲁兰酶活性测定一一菌株鉴定一一下游研宄。 虽然目前有一些产普鲁兰酶野生菌株的文献报道，但真正能够用于工业化生产是菌很少，迄今为止，应用最为成功和广泛的仍然仅有Bacillus acidopullulliticus。所以，普鲁兰酶活性较高野生菌株的匮乏仍然是限制普鲁兰酶广泛开发应用的瓶颈问题之一，直接或间接的影响了普鲁兰酶产生菌的菌诱变育种和工程菌株的构建。就我国关于普鲁兰酶研宄情况来说，突破性的研宄成果很少，普鲁兰酶专利菌株较少，仍未形成有竞争力的核心菌种资源后备库，没有改变国外在普鲁兰酶生产领域处于垄断地位的现状。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的之一是为提供一种蒺藜内生菌中具有普鲁兰酶活性的菌株及其人工培养方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的:本专利技术提供的一种蒺藜内生菌中普鲁兰酶活性菌株，其菌株属肠杆菌(Enterobacter sp.)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址:中国、武汉、武汉大学，保藏号为CCTCC M 2015071，该菌株具有普鲁兰酶活性。本专利技术提供的一种蒺藜内生菌中普鲁兰酶活性菌株的培养方法，包含以下培养步骤:富集培养:取蒺藜的健康茎冲洗后剪成小段，两端用融化的石蜡封口，再用无菌水冲洗，放入体积百分比为70%乙醇溶液表面消毒，再用0.lmol/L升汞消毒，无菌操作条件下剪去两端的封口石蜡，将剩余的茎放入研钵充分研磨，收集于装有富集培养基的试管中摇床培养。分离培养:无菌操作条件下取适量富集培养液涂布于固体分离培养基中培养。用接种环选取单菌落，在固体分离培养基平板上划线纯化。然后通过滴加卢氏碘液的方法初筛产普鲁兰酶菌株，选菌落小而水解圈较大者作为目标菌株。复筛:将所述目标菌株接种于鉴别培养基中培养，然后滴加卢氏碘液，将具有水解圈者确定为具有普鲁兰酶活性的菌株，同时转接于LB培养基4°C斜面保藏。所述富集培养步骤中，所述摇床培养条件为30°C、180r/min ;所述分离培养步骤中培养条件为30°C恒温培养48h ;所述复筛步骤中的培养条件为30°C恒温培养48h。所述富集培养基各组分浓度为:糯米淀粉25g/L，海藻糖0.5g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 9g/L，自然pH。所述固体分离培养基各组分浓度为:支链淀粉3g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 9g/L，琼脂粉 18g/L，pH 为 7.0。所述鉴别培养基各组分浓度为:普鲁兰糖2g/L，蛋白胨8g/L，酵母提取物2g/L，NaCl 9g/L，琼脂粉 18g/L，pH 为 7.0。所述LB培养基各组分浓度为:胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 9g/L，pH为 7.0o本专利技术的有益效果在于:本专利技术以蒺藜为材料，对其内生具有普鲁兰酶活性菌株进行了筛选和鉴定，筛选出能够高效降解普鲁兰糖的内生菌株；富集培养基通过合理调整各组分含量，有利于弱势菌株的存活与培养；通过常规形态学、生理生化特征、16S rDNA同源序列和系统进化树分析，对筛选出的具有普鲁兰酶活性的菌株进行了多相分类鉴定，获得了菌株的一般特征及16S rDAN基因序列，确定隶属于肠杆菌属Enterobacter sp.，命名为肠杆菌Enterobacter sp.ZXY25 ;通过DNS法，对该菌株的普鲁兰酶活性测定表明，该菌株具有较高的普鲁兰酶活性，在30°C、180r/min、pH6.0条件下发酵培养56h，产酶量可达4.19U/mL，可作为良好的诱变出发菌株和构建工程菌的普鲁兰酶基因备选菌株。【附图说明】图1所示为本专利技术菌株ZXY25在普鲁兰糖平板上的水解圈图。图2所示为本专利技术菌株ZXY25的普鲁兰酶活性图。图3所示为本专利技术菌株ZXY25的一般特征图。图4所示为本专利技术菌株ZXY25基于16S rDNA基因序列的系统发育树。【具体实施方式】下文将结合具体实施例详细描述本专利技术的内容。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。实施例1图1所示为本专利技术菌株ZXY25在普鲁兰糖平板上的水解圈图；图2所示为本专利技术菌株ZXY25的普鲁兰酶活性图；图3所示为本专利技术菌株ZXY25的一般特征图；图4所示为本专利技术菌株ZXY25基于16S rDNA基因序列的系统发育树。1、试验材料蒺藜的来源:采自洛阳市区洛河堤岸。富集培养基:糯米淀粉25g，海藻糖0.5g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 9g，蒸饱水定容至lOOOmL，自然pH。固体分离培养基:支链淀粉3g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 9g，琼脂粉18g，蒸饱水定容至lOOOmL，pH7.0。鉴别培养基:普鲁兰糖2g，蛋白胨8g，酵母提取物2g，NaCl 9g，琼脂粉18g，蒸馏水定容至 100mL, ρΗ7.0。LB培养基:胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 9g，蒸馏水定容至lOOOmL，pH7.0。发酵培养基:玉米淀粉25g本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蒺藜内生菌中普鲁兰酶活性菌株，其特征在于，该菌株隶属于肠杆菌(Enterobacter sp.)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2015071，该菌株具有普鲁兰酶活性。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙会忠，王小东，朱金峰，李广良，孙明辉，
申请(专利权)人：孙会忠，
类型：发明
国别省市：河南;41