本发明专利技术技术中的NK细胞分离、培养扩增方法能够从外周血分离获得高活性的淋巴细胞群，体外经过一系列细胞因子的刺激，NK细胞（CD3-CD56+）得到纯化、活化和大量扩增，达到应用于临床治疗肿瘤的水平。本发明专利技术技术中NK细胞活性检测方法不仅能在免疫细胞和肿瘤细胞的混合细胞液中特异性地分析效应细胞对靶细胞的杀伤率，避免了效应细胞对检测结果的干扰，而且能分析早期凋亡和晚期凋亡靶细胞，其方法简便易行、灵敏度高，可以在单个细胞水平检测细胞的杀伤功能，在过继免疫细胞治疗肿瘤的临床应用前基础研究和临床应用中质控方面具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术技术主要涉及一种实体瘤患者自体外周血来源NK细胞体外分离培养、活 化扩增和细胞毒活性检测方法。
技术介绍
自然杀伤细胞（natural killer cell，NK)又称天然杀伤细胞，其抗病毒感染、抗 肿瘤无 MHC限制性，已作为临床细胞免疫治疗肿瘤的一个重要治疗手段。NK细胞作为机体 天然免疫细胞，主要通过直接杀伤肿瘤细胞和分泌细胞因子调节其他免疫细胞两种途径杀 死肿瘤细胞、病毒和清除非己细胞。Rosenberg等在应用IL-2活化的LAK细胞治疗肿瘤过 程中发现：其中以⑶3-0)16+细胞（natural killer cell，NK)为特征的细胞发挥抗肿瘤 的主要作用，NK细胞是主要的效应细胞。从此，研宄者们将肿瘤免疫细胞治疗的研宄重点 从LAK细胞转向NK细胞，将NK细胞作为肿瘤免疫治疗的一种重要手段。到目前为止，NK细 胞治疗肿瘤已经取得了很好的临床效果，尤其是在血液肿瘤方面。同种异体NK细胞在杀伤 血液病细胞的同时，可以促进造血干细胞植入、降低GVHD的发生以及增强移植物抗白血病 (GVL)效应。同种异体NK细胞已成为临床移植辅助治疗的一种重要手段。 NK细胞治疗过程主要包括三个步骤：采集分离、纯化、活化扩增。目前治疗血液肿 瘤所用到的NK细胞主要通过磁珠分选的方法，这种方法不适合自体NK细胞治疗实体瘤。主 要原因是：①治疗血液肿瘤一般选择健康的供者，可以提取到大量的细胞，不需要体外长时 间的培养扩增就已经能够达到治疗所需要的数量，可以直接将提取出的高纯度NK细胞经 过检测后静脉回输给患者，采集患者自体外周血中的NK细胞比例低，并且受到自身肿瘤细 胞的免疫耐受，分离以后需要经过长时间的刺激、培养、扩增的过程，达到一定数量和比例 才能给患者回输；②由于在磁珠分选的过程中细胞的活性受到影响，不适合在体外长时间 的培养。密度梯度离心法是利用细胞的物理特性一一血液中各种细胞的密度不同分离所需 要的细胞的方法，由于是物理的方法，对细胞的损伤比较小，不影响细胞活性。密度梯度离 心法分离过程中的试剂目前已经由临床级别的，这种方法分离外周血中NK细胞是一种适 合实体瘤患者自体NK细胞治疗的经济实用方法。 NK细胞纯化的方法主要包括物理方法和化学方法。物理方法有！Percoll不连续 密度梯度离心法、两步黏附法；化学方法有：去除单核细胞、绵羊红细胞花环法、磁珠分选 法、补体依赖的细胞毒法。活化和扩增过程主要是加入的不同刺激因子，通过这些刺激因子 促进NK细胞的快速增殖，而降低非NK细胞增殖速度。主要刺激因子有：丝裂原、细胞因子、 饲养细胞等。 Grzywacz等从脐带血提取造血干细胞，然后经过分化和诱导扩增得到大量NK细 胞，虽然脐带血的来源比较丰富，但存在伦理问题。Berg等使用IOOGy照射后的EB病毒转 化的B淋巴母样细胞（EBV-LCL)作为饲养细胞，与PBMC中分选的NK细胞共培养培养21d 后，可使NK细胞扩增（490±260)倍。Imai等使用照射过的K562-mbl5-41BBL细胞株作为 饲养细胞，3周后可使PBMCs中⑶3-⑶56+NK细胞扩增1000多倍。饲养细胞可提高NK细胞 扩增效率、纯度与杀伤活性均较高，但存在安全性问题。随着生物技术的发展，现在已较少 使用饲养细胞，更侧重于细胞因子的组合体外活化和扩增NK细胞。临床级磁珠分选仪随着 干细胞的研宄已经逐步进入了临床，其设备及其附属耗材价格昂贵。自体NK细胞首先经过 临床级磁珠分选仪纯化后，需要扩增和增殖，这将增加治疗成本，临床病人难以接受。目前 临床级磁珠分选仪在我国还没有得到相关部门的认证用于临床。 已知许多细胞因子单独或组合能有效地诱导、刺激NK细胞增殖和促进其分化成 熟，如 IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、Flt-3L、SCF 等，其中 IL-2 和 IL-15 的作用尤为 明显。IL-2是一种具有多种生物学活性的细胞因子，主要由⑶4+T、⑶8+T细胞以及NK，LAK 细胞产生，在免疫应答网络中起重要作用。IL-2能刺激NK细胞增殖，并增强NK细胞杀伤功 能，是体外NK细胞扩增体系中最早也是最常用的细胞因子。 目前，国内外很多文献和专利关于NK细胞分离提取和活化扩增的方法，但是存在 一些缺点，实际应用到临床上的并不多。①细胞数量：临床治疗需要的NK细胞数量大，而采 集50ml患者自体外周血中NK细胞的含量比较少；②细胞纯度：需要NK细胞纯度高，而外 周血中NK细胞约占淋巴细胞的5%~10% ;③细胞来源：目前治疗实体瘤NK细胞的主要来 源是有患者本人的外周血，治疗血液病的NK细胞可以来源于健康志愿者（患者的父母子女 或兄弟姐妹)。同种异体NK细胞治疗实体瘤还处于临床试验阶段；④添加因子：在培养的 过程中，不能加入动物源性和其它在细胞回输后对人体产生负作用的添加剂；⑤操作过程： 繁琐的操作步骤将增加污染的几率；⑥体外培养时间：免疫细胞在体外培养时间的长或短 决定了回输到体内免疫细胞的活性。如果培养时间太短，细胞还没有扩增到一定数量，如果 时间太长，细胞量虽然较多，但细胞表现为复制性衰老（replicative senescence)，绝大多 数细胞已经开始凋亡，不论是从细胞总数和活性还是从细胞比例都会有下降的趋势，而且 将这种状态的细胞回输到体内后，绝大多数细胞会死亡，这提示我们必须选择合适的培养 时间；⑦成本：如果培养过程中使用一些非常昂贵的试剂或仪器设备，超出了一般患者所 能够承受的经济范围。NK细胞的体外分离和高效扩增方案成为NK细胞临床治疗中需要迫 切解决的一个关键问题。 按照我国相关规定，在过继免疫细胞临床应用前和应用过程中，应检测免疫细胞 的细胞毒作用。有报道指出，由于两种细胞混合在一起培养，互相之间有抑制对方生长的细 胞因子的分泌，在效应细胞杀伤肿瘤细胞的同时，肿瘤细胞对效应细胞也会有抑制生长和 促进凋亡的作用。目前常用检测凋亡的方法MTT法和LDH法只能从整体水平判断凋亡率， 而不能从单细胞水平检测免疫细胞的细胞毒作用，并且这些方法容易受到背景信号的干 扰，因此其检测结果广受质疑。51Cr释放实验一直被认为是检测NK细胞活性的标准方法， 但作为放射性核元素，51Cr的应用具有一定的限制性。TUNEL法能准确地反应细胞凋亡最典 型的生物化学和形态特征，可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度高，但只能标记中晚期凋亡 细胞，并受效应细胞和靶细胞自发死亡和非特异性杀伤的存在会造成很强的背景信号的影 响，而且方法操作繁琐。Annexin-V/PI流式细胞分析法是目前研宄免疫细胞细胞毒作用最 常用的流式方法，能检测早期凋亡细胞，与51Cr释放实验结果一致。这种方法适用于一种作 用因素(化疗药或其他非细胞物质)对一种靶细胞的作用研宄。检测免疫细胞对肿瘤细胞的 细胞毒作用时，两种细胞混合在一起，效应细胞和靶细胞同时都有凋亡，流式细胞仪分析时 无法区分效应细胞和靶细胞，结果中包括靶细胞和效应细胞共同的凋亡率。如果效应细胞 和靶细胞的体积相差比较大时，能通过FSC/SSC圈门将两种细胞区分开；当靶细胞和效应 细胞体积相当时，在所分析的靶细胞区域中混有效应细胞，最终得出的凋亡本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种实体瘤患者自体NK细胞分离、活化扩增方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）、NK细胞的采集分离：1.1、外周血采集：来源实体肿瘤患者自体外周血40~60ml；1.2、NK细胞分离：1.2a、将采集的外周血装入离心管中，离心条件：离心力500g，离心时间10min；吸出血浆装入另一只离心管，于56℃水浴锅中灭活30min后离心，离心条件：离心力850g，离心时间10min；离心后取上清装入离心管中放入4℃冰箱中备用；1.2b、将沉淀的红细胞层与生理盐水按照1:1混合，缓慢加入装有分离液的离心管中，在移动或装入离心机时防止血细胞层与分离液层混合，离心条件：离心力700g，离心时间15min，离心温度20~25℃；将上述分离后的白膜层移至另一离心管，再加入同等量生理盐水，洗涤两次，第一次洗涤时离心条件：离心力750g，离心时间5min；第二次洗涤时离心条件：离心力500g、离心时间5min；（2）、NK细胞活化扩增：2.1、取CD16mAb加入装有PBS的培养瓶中，使抗体终浓度为1~10ug/mL，将培养瓶放于4℃冰箱中，包被抗体至少三天以上，用PBS洗两遍备用；2.2、将步骤（1）分离获得的细胞洗涤后计数，加入新鲜培养液，该新鲜培养液为临床级无血清培养基，所述临床级无血清培养基含IL‑2和10%自体血浆，细胞浓度为1×106/mL~2×106/mL；转入已包被抗体的培养瓶中并加入IFN‑γ；IFN‑γ浓度为100~1000U/mL，IL‑2浓度为1000~2000U/mL；2.3、NK细胞培养扩增2.3a、培养第3天观察细胞状态，加入等倍体积新鲜培养液，该新鲜培养液为临床级无血清培养基，所述临床级无血清培养基含IL‑2和10%自体血清，新鲜培养液中IL‑2的浓度为1000U/mL~2000U/mL；2.3b、第5天观察细胞状态，加入2倍体积新鲜培养液，该新鲜培养液为含IL‑2的临床级无血清培养基，新鲜培养液中IL‑2的浓度为1000U/mL~2000U/mL；2.3c、之后，隔天加入等倍体积的新鲜培养液，该新鲜培养液为含IL‑2的临床级无血清培养基，新鲜培养液中IL‑2的浓度为1000U/mL~2000U/mL；培养至第17或18天，获得处于对数生长期的NK细胞。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张俊萍，郭继强，韩亚萍，贾原，赵晴，李芳，
申请(专利权)人：山西大医院，
类型：发明
国别省市：山西;14
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