本发明专利技术公开了马铃薯的一种DNA指纹图谱及其获取方法与其专用引物。所述获取马铃薯DNA指纹图谱的专用引物，由序列表的序列SEQ ID NO:1~7组成。本发明专利技术提供的方法包括如下步骤：提取马铃薯的基因组DNA；以基因组DNA为模板，利用所述专用引物进行PCR扩增；将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，用EB染色显示马铃薯的DNA指纹图谱。本发明专利技术获得的马铃薯DNA指纹图谱多态性高、指纹丰富，为提高马铃薯选择育种的准确性和效率，缩短育种周期，及马铃薯的分子标记辅助育种奠定了技术基础。
【技术实现步骤摘要】
马铃薯的一种DNA指纹图谱及其获取方法与其专用引物
本专利技术涉及马铃薯的一种DNA指纹图谱及其获取方法与其专用引物。
技术介绍
马铃薯属茄科多年生草本植物，块茎可供食用，是世界第四大重要的粮食作物。我国是全球马铃薯生产第一大国，我国马铃薯育种以品种间或种间杂交为主。据不完全统计，自20世纪40年代到2000年间，中国共育成马铃薯品种170多个。近年来，随着我国马铃薯育种进程加快，育成的品种数量迅速增加，2000-2007年省级以上共审定品种近110个。但由于早期对马铃薯品种缺乏系统完善的鉴定方法，致使出现同种多名和同名多种等现象，品种混乱问题给马铃薯生产造成很大损失。以往马铃薯品种鉴定一直是基于传统的形态学特征，这些性状易受环境条件影响。此外，我国育成马铃薯品种的亲本基本上是五、六十年代引自欧洲的四倍体栽培品种，亲缘关系近，后代的遗传变异停留在近交水平，因此对其进行形态学鉴定及分类相当困难。因此，如何快速准确鉴别马铃薯品种种质资源，已成为当前马铃薯生产及科研中急需解决的问题。与形态标记相比，分子标记是建立在基因组DNA基础之上，其能对各发育时期的生物个体、组织、器官甚至细胞进行检测，不受基因表达的影响，具有操作简便、数量丰富、及多态性高等特点(Kumer，1999)。实践证明，分子标记可对种质资源进行准确、科学的鉴定和评价，为育种工作者提供直接、可靠的依据(邸宏等，2006)。为了充分有效地利用马铃薯丰富的种质资源，需要建立高效的马铃薯DNA分子标记技术体系并利用其对马铃薯种质资源进行鉴定和评价。
技术实现思路
针对以上技术问题，本专利技术的目的在于提供马铃薯的一种DNA指纹图谱及其获取方法与其专用引物，更充分地、有效地利用马铃薯丰富的种质资源。本专利技术提供的一种获取马铃薯DNA指纹图谱的专用引物，由序列表的序列SEQIDNO:1～7组成。本专利技术还提供了一种获取马铃薯DNA指纹图谱的方法，包括如下步骤：步骤A：提取马铃薯的基因组DNA；步骤B：以步骤A的马铃薯的基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的专用引物进行PCR扩增；步骤C：对步骤B中得到的PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，用EB(溴化乙锭)染色显示马铃薯的DNA指纹图谱。作为本专利技术的进一步改进，步骤B中，所述PCR扩增的程序是：94℃预变性4min，94℃变性30s，50℃退火1min，72℃延伸1.5min，其中，变性、退火和延伸三个步骤循环35次，72℃最后一步延伸10min，10℃保存。作为本专利技术的进一步改进，所述PCR扩增的体系为20ul，包括：10×PCR含Mg2+的Buffer2.0ul，2.5mM的dNTP0.5ul，10pmol/ul每条专用引物1ul，2.5U/ul的Taq酶0.4ul，50ng/ul的DNA模板1.0ul，ddH2O补足。作为本专利技术的进一步改进，所述马铃薯的基因组DNA来自马铃薯植株的幼嫩叶片。利用所述的方法得到的马铃薯DNA指纹图谱也属于本专利技术的保护范围。本专利技术还提供了所述的专用引物在获取马铃薯DNA指纹图谱中的应用。本专利技术还提供了一种获取马铃薯DNA指纹图谱的试剂盒，所述试剂盒还有如上所述的SEQIDNO:1～7专用引物。采用本专利技术的专用引物和本专利技术的方法获得的马铃薯DNA指纹图谱多态性高、指纹丰富、重复性好，在提高马铃薯选择育种的准确性和效率，缩短育种周期，以及马铃薯的分子标记辅助育种中发挥重要作用。附图说明图1为本专利技术应用所述专用引物P1获得的马铃薯的DNA指纹图谱。图2为本专利技术应用所述专用引物P2获得的马铃薯的DNA指纹图谱。图3为本专利技术应用所述专用引物P3获得的马铃薯的DNA指纹图谱。图4为本专利技术应用所述专用引物P4获得的马铃薯的DNA指纹图谱。图5为本专利技术应用所述专用引物P5获得的马铃薯的DNA指纹图谱。图6为本专利技术应用所述专用引物P6获得的马铃薯的DNA指纹图谱。图7为本专利技术应用所述专用引物P7获得的马铃薯的DNA指纹图谱。图8为本专利技术实施例2的9份马铃薯品种的聚类树状图。图中，M代表DNAMarkerDL2000，从上到下条带大小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；编号1-9分别对应中薯11号、中薯7号、中薯14号、费乌瑞它、中薯8号、冀张薯8号、中薯13号、中薯6号、中薯17号。具体实施方式下面结合附图，对本专利技术的较优的实施例作进一步的详细说明。以下实施例中所用的9个马铃薯品种如下：1.中薯11号、2.中薯7号、3.中薯14号、4.费乌瑞它、5.中薯8号、6.冀张薯8号、7.中薯13号、8.中薯6号、9.中薯17号。以下实施例中所用到的马铃薯样品均源自于广西壮族自治区农业科学院经济作物研究所。实施例1利用专用引物获取马铃薯的DNA指纹图谱操作流程：提取马铃薯基因组DNA→PCR扩增→琼脂糖凝胶电泳→EB染色→获得清晰DNA指纹图谱→统计分析结果。具体方法和过程如下：1、DNA提取采用改良具体CTAB法(十六烷基三甲基溴化铵法)提取马铃薯样本的DNA。包括以下分步骤：(1)取新鲜马铃薯嫩叶，每个品种取0.3-0.5g，用剪刀剪碎，放入研钵中并在研钵中加入1g的PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，分多次倒入足量的液氮，将叶片样品充分研磨成粉末状。(2)将全部粉末样品转移到事先加入了1.0mlCTAB提取液且经过65℃预热的2ml离心管中，再加入20μlβ-巯基乙醇，于65℃水浴锅中温浴60min，期间上下充分颠倒混匀，以便DNA充分析出。(3)在4℃冷冻离心机中以转速为12000rpm离心10min后除去底部残渣，吸取上清液到另外一支2ml干净的离心管，并在上清液中加入0.5μl的RNaseA(核糖核酸酶A)，上下充分颠倒混匀，静置5min。(4)加入与上清液等体积的氯仿抽提，上下充分颠倒混匀，静置5min，然后在冷冻离心机中以转速为12000rpm离心10min。(5)吸取上清液并加入与上清液等体积且事先在-40℃预冷的无水乙醇于-40℃冰箱中沉淀30min，用白色小枪头或牙签将沉淀挑出来到新的干净的1.5ml离心管中，用75％vol乙醇洗涤沉淀二遍，再用600μlDEPC水充分溶解沉淀。(6)加入600μlTris平衡酚充分混匀抽提，静置5min，4℃冷冻离心机中以转速为12000rpm离心10min。(7)取上清液并在上清液中加入与上清液等体积的事先预冷的无水乙醇于-40℃冰箱中沉淀30min，再次用白色小枪头或牙签将白色沉淀挑出来到新的干净的1.5ml离心管中，用75％vol乙醇洗涤沉淀二遍，短时间(5min左右)晾干后，用200μlDEPC水或TE溶解沉淀。2、PCR扩增以步骤1中得到的马铃薯样本的基因组DNA为模板，分别采用序列表的专用引物序列进行PCR扩增；所述专用引物的序列为：P1：GAATTCCGGCGGCGATC；如SEQIDNo:1所示。P2：GAATTCCGGCGGCGAAC；如SEQIDNo:2所示。P3：GAATTCCGGCGGCGTAC；如SEQIDNo:3所示。P4：GAATTCCGGCGGCGTCG；如SEQIDNo:4所示。P5：GAATTCCGGCGGCGTGA；如SEQIDNo:5所示。P6：GAATT本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种获取马铃薯DNA指纹图谱的专用引物，由序列表的序列SEQ ID NO:1~7组成。
【技术特征摘要】
1.一种获取马铃薯DNA指纹图谱的专用引物，由序列表的序列SEQIDNO:1~7组成。2.一种获取马铃薯DNA指纹图谱的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤A：提取马铃薯的基因组DNA；步骤B：以步骤A的马铃薯的基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的专用引物进行PCR扩增；步骤C：对步骤B中得到的PCR扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，用EB染色显示马铃薯的DNA指纹图谱。3.根据权利要求2所述的获取马铃薯DNA指纹图谱的方法，其特征在于：步骤B中，所述PCR扩增的程序是：94℃预变性4min，94℃变性30s，50℃退火1min，72℃延伸1.5min，其中，变性...
【专利技术属性】
技术研发人员：熊发前，刘俊仙，蒋菁，唐秀梅，贺梁琼，黄志鹏，李忠，韩柱强，钟瑞春，唐荣华，何海旺，唐洲萍，
申请(专利权)人：广西壮族自治区农业科学院经济作物研究所，
类型：发明
国别省市：广西;45
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