用于生产糖基化免疫球蛋白的方法技术

本文报道了用于生产免疫球蛋白的方法，所述方法包括下列步骤：a)提供包含编码免疫球蛋白的核酸的真核细胞，b)在培养基中培养真核细胞，其中每时间单位培养基中可用的葡萄糖的量保持恒定，并限制在少于每时间单位培养基中细胞最大利用的量的80％，和c)从培养物中回收免疫球蛋白。

【技术实现步骤摘要】
【专利说明】 本申请为2010年10月25日提交的、专利技术名称为"用于生产糖基化免疫球蛋白的 方法"的PCT申请PCT/EP2010/066073的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期 为2012年4月26日，申请号为201080048412. 2。 本文报道在细胞中生产免疫球蛋白的领域的方法，从而可以基于培养条件修饰所 生产的免疫球蛋白的糖基化模式。 专利技术背景 近年来免疫球蛋白的生产稳定增加并且在不久的将来，免疫球蛋白可能将成为多 种疾病治疗可用的治疗法的最大组别。免疫球蛋白的影响源自其特异性，所述特异性包括 其特异性的靶识别和结合功能以及与抗原/Fe受体结合的同时或之后特定效应的活化。 特异性的靶识别和结合由免疫球蛋白的可变区介导。产生效应的免疫球蛋白分子 的其他部分是翻译后修饰，例如糖基化模式。翻译后修饰对免疫球蛋白的效力、稳定性、免 疫原性潜力、结合等确实具有影响。在此，必须提及依赖于补体的细胞毒性（CDC)、抗体依赖 性细胞毒作用（ADCC)和诱导凋亡。 已报道免疫球蛋白的糖基化模式，即附着的糖基结构的糖组成和数量对生物 学性质具有强烈影响（参见例如 Jefferis，R· ,Biotechnol. Prog. 21(2005) 11-16)。由 哺乳动物细胞生产的免疫球蛋白含有以质量计2-3%的碳水化合物〇'&1^811(*1，1'. 等人，Biochem. 24(1985)5551-5557)。例如，在G类免疫球蛋白（IgG)中，这等价 于在小鼠来源的IgG中的2. 3个寡糖残基（Mizuochi, T.等人，Arch. Biochem. Biophys. 257(1987)387-394)和在人来源的IgG中的2. 8个寡糖残基（Parekh，R. 等人， Nature 316(1985)452-457)，其中一般地两个位于Fe区而剩余的位于可变区（Saba, J. Α·等人，Anal. Biochem. 305 (2002) 16-31)。 在G类免疫球蛋白的Fe区中，能够通过在297位的氨基酸残基的N-糖基化引入 寡糖残基，所述氨基酸残基是天冬酰胺残基（被标注为Asn297)。Youings等人展示在15% 至20 %的多克隆IgG分子的Fab区中存在其他N-糖基化位点（Youings，A.等人，Biochem. J.，314(1996)621-630 ;还参见例如，Endo, T.等人，Mol. Immunol. 32(1995)931-940)。由 于非均一的（即不对称的）寡糖加工，存在具有不同糖基化模式的免疫球蛋白的多种同 种型（Patel, T. P.等人，Biochem. J. 285(1992)839-845 ;Ip, C. C.等人，Arch. Biochem. Biophys. 308 (1994) 387-399 ;Lund, J.等人，Mol. Immunol. 30 (1993) 741-748)。寡糖的 结构和分布都同时是高度可重现的（即，非随机的）和位点特异性的（Dwek，R. A.等人， J.Anat. 187(1995)279-292)。 免疫球蛋白的一些特征与Fc区的糖基化直接相关（参见例如Dwek, R.A.等 人，J. Anat. 187 (1995) 279-292 ;Lund, J.等人，J. Immunol. 157 (1996) 4963-4969 ; Lund, J. ,FASEB J. 9(1995)115-119 ； Wright,A.和 Morrison，S· L·，J· Immunol. 160 (1998) 3393-3402)，例如热稳定性和溶解性（West，C. M，Mol. Cell.Biochem.72 (1986) 3_20)、抗原性（Turco，S.J.，Arch.Biochem. Biophys. 205 (1980) 330-339)、免疫原性（Bradshaw，J.P.等人，Biochim.Biophys. Acta 847 (1985) 344-351 ;Feizi，T.和 Childs, R. A. ,Biochem.J. 245(1987) 1-11; Schauer, R.，Adv. Exp. Med. Biol. 228 (1988) 47-72)、清除率 / 循环半寿期（Ashwell, G. 和 Harford, J.，Ann. Rev. Biochem. 51 (1982) 531-554 ;McFarlane, I. G.，Clin. Sci. 64(1983) 127-135 ；Baenziger, J. U. , Am. J. Path. 121 (1985) 382-391 ；Chan, V. T.和 Wolf, G·，Biochem. J.247(1987)53_62;Wright，A.等人，Glycobiology 10 (2000) 1347-1355 ;Rifai, A.等人，J. Exp. Med. 191 (2000) 2171-2182 ;Zukier, L. S.等人， Cancer Res. 58(1998)3905-3908)，和生物学比活性（JefTeris，R·和Lund, J·，in Antibody Engineering, Capra, J. D.编著，Chem. Tmmunol · Basel, Karger, 65 (1997) 111-128) 〇 已研宄了影响糖基化模式的因子，例如发酵基质中存在胎牛血清 (Gawlitzek，M.等人，J.Biotechnol.42(2) (1995) 117-131)、缓冲条件（MUthing，J. 等人，Biotechnol.Bioeng. 83(2003)321-334)、溶解氧浓度（Saba, J. Α·等人，Anal. Biochem. 305 (2002) 16-31 ;Kunkel, J. Ρ·等人，J. Biotechnol. 62 (1998) 55-71 ;Lin, Α· Α·等 人，Biotechnol. Bioeng. 42 (1993) 339-350)、寡糖的位置和构象以及宿主细胞类型和细胞 生长状态（Hahn, T. J.和 Goochee, C. F.，J. Biol. Chem. 267 (1992) 23982-23987 Jenkins, N. 等人，Nat. Biotechnol. 14 (1996) 975-981)、细胞核苷酸-糖代谢（Hills, A. E.等人， Biotechnol.Bioeng. 75(2001)239-251)、养分限制（Gawlitzek, Μ.等人，Biotechnol. Bioeng. 46 (1995) 536-544 ;Hayter，P.M.等人，Biotechnol. Bioeng. 39 (1992) 327-335)， 特别地葡萄糖限制（Tachibana，H.等人，Cytotechnology 16(1994) 151-157)，和胞外 pH(Borys，M.C.等人，Bio/Technology本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于生产免疫球蛋白的方法，所述方法包括：a)在培养基中培养包含编码免疫球蛋白的核酸的真核细胞，其中培养基中单个细胞当前的比葡萄糖消耗速率与该种细胞的最大已知的比葡萄糖消耗速率的比例保持恒定，和b)从培养物中回收免疫球蛋白。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：R·弗兰策，平岛亲，T·林克，高本良智，田熊晋也，津田祐理子，
申请(专利权)人：弗·哈夫曼拉罗切有限公司，中外制药株式会社，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH