生产蛋白的方法技术

本发明专利技术涉及通过收获微生物细胞培养液并添加一定量絮凝剂以实现有效粒径分布来生产重组蛋白的方法。本发明专利技术还涉及通过添加一定量絮凝剂以实现有效粒径分布来澄清微生物收获物的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】 本专利技术涉及通过收获微生物细胞培养液并添加一定量絮凝剂以实现有效粒径分 布来生产重组蛋白的方法。本专利技术还涉及通过添加一定量絮凝剂以实现有效粒径分布来澄 清微生物收获物的方法。 专利技术背景 重组蛋白的大规模制造是生物技术工业的重要挑战。重组蛋白通常由宿主细胞培养物 或经由无细胞的系统生产。在每种情况下，将蛋白从包含杂质的样品纯化至足以用作人治 疗产品的纯度。典型工艺涉及初始澄清以移除固体微粒，随后纯化以确保足够纯度。澄清 可降低对纯化期间后续层析步骤的负荷。 典型澄清步骤包含离心步骤或过滤步骤或二者。在澄清之前，可使用预处理步骤 作为调节样品的方法。调节预处理步骤的实例是絮凝，其引起固体微粒形成较大聚集物，随 后通过澄清移除所述较大聚集物。 对使用絮凝剂的许多焦点是增加存在于样品中的固体微粒的粒径以改善澄清效 率。这是因为较大聚集物通过离心更易于移除。 澄清方法的开发通常涉及选择有效量的絮凝剂以（i)最大化固体微粒移除、（ii) 保存产品质量和产品回收率、（iii)最小化所用絮凝剂的量（过多会引起浑浊）、（iv)最小 化絮凝剂对后续纯化步骤（例如层析步骤）的影响和（V)确保絮凝剂移除至治疗产品中的 可接受水平。 因此，在选择有效量的絮凝剂以实现期望效应同时最小化不期望效应时，必须实 现小心平衡。 用以测定有效量的絮凝剂的经验测试通常在澄清和纯化工艺的不同阶段实施，所 述工艺包括评价以下之一或组合：(a)絮凝物特性，诸如（i)絮凝物的形成（絮凝的起始） 和絮凝物的破裂；（ii)絮凝物大小；（iii)絮凝物的机械稳定性/强度；（iv)絮凝物的表面 剪切抗性；(b)澄清效率；（c)滤过性；和（d)纯化。此类经验测试可耗时且费力。 因此，需要生产重组蛋白的微生物细胞收获物的更有效澄清方法。 专利技术概沐 本专利技术提供生产重组蛋白的方法，其中所述方法包括： (a) 收获表达重组蛋白的微生物细胞培养液；和 (b) 添加一定量絮凝剂以实现如下体积粒径分布：约5%或更少的颗粒在5 μπι或更小 的大小范围内。 在另一方面，本专利技术提供生产重组蛋白的方法，其中所述方法包括： (a) 收获表达重组蛋白的微生物细胞培养液； (b) 添加一定量絮凝剂以实现如下体积粒径分布：约5%或更少的颗粒在5 μπι或更小 的大小范围内；和 (C)澄清絮凝收获物。 在另一方面，本专利技术提供生产重组蛋白的方法，其中所述方法包括： (a)收获表达重组蛋白的微生物细胞培养液； (b)添加一定量絮凝剂以实现如下体积粒径分布：约5%或更少的颗粒在5 μπι或更小 的大小范围内； (C)澄清絮凝收获物；和 (d)从澄清絮凝收获物纯化重组蛋白。 在另一方面，本专利技术提供澄清微生物收获物的方法，其中所述方法包括： (a) 收获微生物细胞培养液； (b) 添加一定量絮凝剂以实现如下体积粒径分布：约5%或更少的颗粒在5 μπι或更小 的大小范围内；和 (C)澄清絮凝收获物。 在又一方面，本专利技术提供修饰的大肠杆菌细胞收获物，其中： (a) 细胞表达细胞周质靶向重组蛋白； (b) 收获物包含0.01-2% PEI ;且 (c) 收获物的体积粒径分布为约5%或更少的颗粒在5 μ m或更小的大小范围内。 附图简沐 图1 :显示DOMlOO收获物的粒径分布，其中添加0. 005%、0. 05%、0. 1%、0. 5%和2% PEI。 图2 :Dat06收获物的直径等于或小于5 μπι的颗粒的体积％，其中添加0. 03%、 0· 05%、0· 1%、0· 5% 和 2. 0% ΡΕΙ。 图3 :D0M101收获物（空心圆）和暴露于高剪切的收获物（闭合圆）的粒径分布。 大小分布表不为（a)总体积粒径分布（log标度）；强调峰1 (插图b)、峰1和2 (插图c)， 以及峰3 (插图d)的粒径分布。 图4 :用0· 5% PEI处理的DOMlOl收获物（闭合圆）和用低剪切（十字形）和高 剪切（空心圆）处理的PEI絮凝收获物的粒径分布。大小分布表示为（a)总体积粒径分布 (log标度）；强调峰1 (插图b)、峰1 (插图c)，以及峰2 (插图d)的粒径分布。 图5 :PEI浓度对D0M100微生物培养液收获物浊度（进料浊度）和离心后浊度（离 心液（centrate)池度）的影响。 图6 :D0M0101收获物（a)和0. 5% PEI存在下的D0M101收获物（b)的剩余固体％ 的超比例缩减模型。还代表经受无剪切（闭合圆）、低剪切（十字形）和高剪切（空心圆） 的样品。 图7 :PEI浓度对D0M100收获物离心液的主要过滤器容量的影响。 图8 :三种不同絮凝剂对示例性蛋白Dat06和D0M100的收获物中的DNA浓度的影 响。 图9 :0. 5% PEI对示例性蛋白D0M0101收获物离心液的滤过性的影响。 图10 :在不同收获物诱导后时间，有和无0. 5% PEI处理的D0M0101收获物离心液 的滤过性的Vniax的变化。 图11 :解冻D0M101收获物（空心圆）和用高剪切处理的解冻收获物（闭合圆）的 粒径分布。大小分布表示为（a)总体积粒径分布（log标度）；强调峰1(插图b)、峰1、2和 3 (插图c)，以及峰3和4 (插图d)的粒径分布。 图12 :解冻D0M101收获物（闭合圆）和用高剪切处理的0. 5% PEI解冻收获物 (空心圆）的粒径分布。大小分布表示为（a)总体积粒径分布（log标度）；强调子峰（插 图b)、峰I (插图c)、峰1和2 (插图d)，以及峰2的尾端（插图e)的粒径分布。 图13 :在无剪切（闭合圆）、低剪切（十字形）和高剪切（空心圆）存在下用0· 5% PEI处理的解冻DOMlOl收获物的粒径分布。大小分布表不为（a)总体积粒径分布（log标 度）；强调峰1(插图b)、峰1(插图c)，以及峰2(插图d)的粒径分布。 图14 :用剪切解冻D0M101收获物（闭合圆）和均质化解冻D0M101收获物（空心 圆）的粒径分布。大小分布表示为（a)总体积粒径分布（log标度）；强调峰1(插图b)、峰 2和3(插图c)，以及峰3(插图d)的粒径分布。 图15 :解冻D0M101收获物（a)与添加 PEI (b)和随后暴露于低剪切（c)或高剪切 (d)的显微镜图像。 图16 :D0M0101均质化解冻收获物（a)、D0M101解冻收获物（b)和0. 5% PEI絮凝 D0M101解冻收获物（c)的剩余的固体％的超比例缩减模型（如图6的图注）。 图17 :评价具有0-0. 6%的PEI浓度范围和pH4-9的pH范围的DAT06发酵收获 物的：(A)如于A600nm波长下测量的上清液浊度以评价溶液澄清度（0. 2-2. 0的标度）；和 (B)处理能力，如通过在离心力下穿过0· 2 μ m过滤器的直接过滤性能测量（滤液体积标度 为 0-250)。 图18 :用0· 1% PEI (低絮凝剂浓度）和0· 4% PEI (高絮凝剂浓度）和不同离子强 度（导电率）的NaCl溶液处理Dat06收获物。〃低絮凝剂〃和〃高絮凝剂〃仅出于比较原 因使用。在A中评价平均颗粒直径（μ m);且在B中评价彡5 μ m的颗粒的体积％。 图 19 :用 4. 3% CaCl2本文档来自技高网...

【技术保护点】
生产重组蛋白的方法，其中所述方法包括：(a) 收获表达所述重组蛋白的微生物细胞培养液；和(b) 添加一定量絮凝剂以实现如下的体积粒径分布：约5%或更少的颗粒在5μm或更小的大小范围内。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：A查特尔，M霍尔，P孔帕卢梅，JR莫莱克，JM雷克，AD韦伯，
申请(专利权)人：葛兰素集团有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB