本发明专利技术公开了出芽短梗霉二羧酸转运蛋白及其重组载体和应用，出芽短梗霉二羧酸转运蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示，在出芽短梗霉中过表达二羧酸转运蛋白能够提高聚苹果酸产量，并且发酵液中未检测到游离的苹果酸，表明二羧酸转运蛋白基因与聚苹果酸的合成转运有关，为提高聚苹果酸的产量奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及出芽短梗霉二羧酸转运蛋白，还涉及含有出 芽短梗霉二羧酸转运蛋白编码基因的重组载体和出芽短梗霉二羧酸转运蛋白应用。
技术介绍
聚苹果酸（Polymalic acid，PMA)是一种新型的可完全生物降解的聚醋型聚合物， 由于其具有良好的水溶性，生物降解性和生物相容性，可作为药物载体与微胶囊材料、生物 医学材料、吸水材料、化妆品、食品包装等材料，具有广泛的应用前景。此外，聚苹果酸的单 体为L-苹果酸，是一种优良的食品酸味剂和C4平台化合物，市场年需求在10万吨以上。 聚苹果酸主要由出芽短梗霉菌（Aureobasidium pullulans)合成并分泌到胞外， 对聚苹果酸的生物合成途径研宄表明，聚苹果酸可能由TCA循环产生的苹果酸为底物进行 合成，然而苹果酸如何从线粒体转运及参与合成的聚苹果酸如何从胞内转运到胞外，尚未 报道。聚苹果酸聚合物的转运过程不同于单体羧酸的转运，可能存在一些功能独特的转运 蛋白参与。但是目前并无有关出芽短梗霉菌转运蛋白的报道。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供出芽短梗霉二羧酸转运蛋白；本专利技术的目 的之二在于提供含有出芽短梗霉二羧酸转运蛋白编码基因的重组载体；本专利技术的目的之三 在于提供含有重组载体的转化子；本专利技术的目的之四在于提供出芽短梗霉二羧酸转运蛋白 在提高出芽短梗霉聚苹果酸产量中的应用；本专利技术的目的之五在于提供重组载体在提高出 芽短梗霉聚苹果酸产量中的应用。 为实现上述专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案： 1、出芽短梗霉二羧酸转运蛋白，所述出芽短梗霉二羧酸转运蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9 或 SEQ ID NO. 10 所示。 优选的，所述出芽短梗霉二羧酸转运蛋白的基因组序列如SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4 或 SEQ ID NO. 5 所示。 2、含有所述出芽短梗霉二羧酸转运蛋白编码基因的重组载体。 优选的，所述重组载体为在pBARGPEl质粒的EcoRV和XhoI酶切位点之间连入SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4 或 SEQ ID NO. 5 所示序列而得。 3、含有所述重组载体的转化子，优选的，所述转化子为出芽短梗霉；更优选的，出 芽短梗霉为CCTCC M2012223菌株。 4、所述出芽短梗霉二羧酸转运蛋白在提高出芽短梗霉聚苹果酸产量中的应用。 5、所述的重组载体在提高出芽短梗霉聚苹果酸产量中的应用。 本专利技术的有益效果在于：本专利技术首次从真核生物出芽短梗霉克隆了 5个涉及聚 苹果酸有关的二羧酸转运蛋白的基因组序列，利用二羧酸转运蛋白的编码序列，构建过表 达二羧酸转运蛋白的重组载体，将重组载体转化出芽短梗霉后可提高聚苹果酸发酵产量 10-30%，同时发酵液中未检测到游离的苹果酸，表明过量表达的二羧酸转运蛋白基因与聚 苹果酸的合成转运有关；由于聚苹果酸可进一步酸水解制备L-苹果酸，因此本专利技术过表达 二羧酸转运蛋白，也可有效提高L-苹果酸的发酵产量。【附图说明】 为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图： 图1为pBARGPEl质粒结构图。 图2为原生质体转化OE: :g6666转化子基因组中草铵磷抗性基因 bar检测结果。【具体实施方式】 下面将结合附图，对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等 著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 本专利技术通过对公开号为102827778A的中国专利公开的高产聚苹果酸出芽短梗霉 (Aureobasidium pullulans)菌株CCTCC M2012223的全基因组测序分析，结合生物信息学 相关知识预测获得5个可能与聚苹果酸合成转运有关的二羧酸转运蛋白基因的编码序列， 基因序号分别为gl688，g4644，g6666，g5215和g6113，其基因组序列分别如SEQIDN(λl~ 5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO. 6~10所示。 然后设计引物从出芽短梗霉中成功克隆得到5个二羧酸转运蛋白的基因全长，并 通过构建过表达载体，原生质体转化获得转化子，摇瓶和发酵罐发酵试验表明可有效提高 聚苹果酸和苹果酸的发酵产量。 实施例1、克隆二羧酸转运蛋白基因 根据二羧酸转运蛋白基因的编码序列，设计克隆gl688, g4644, g6666, g5215和 g6113的引物，为了便于构建重组载体，在上游引物的5'端设计EcoRV酶切位点，在下游引 物的5'端设计XhoI酶切位点，具体的引物如表1所示。 表1、克隆二羧酸转运蛋白基因的引物 [00231 然后分别以 gl688_up_EcoRV 与 gl688_down_XhoI，g4644_up_EcoRV 与 g4644_ down_XhoI， g6666_up_EcoRV 与 g6666_down_XhoI， g5215_up_EcoRV 与 g5215_down_XhoI， g6113_up_EcoRI与g6113_down_XhoI为引物对，出芽短梗霉基因组DNA为模板进行PCR扩 增，PCR扩增的退火温度为50-65°C，延伸时间为Imin 45s。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电 泳，结果显示获得了与预期大小相同的条带。 实施例2、出芽短梗霉过表达gl688提高聚苹果酸产量 -、质粒构建 将实施例1克隆的gl688基因用EcoR V和Xho I进行酶切，回收gl688基因酶切 片段，同时用EcoR V和Xho I酶切pBARGPEl质粒（图1)，回收载体骨架。然后将回收的 gl688基因酶切片段与pBARGPEl质粒的载体骨架连接，连接产物转化DH5 α感受态细胞，筛 选获得过表达gl688基因的重组表达载体pBARGPEl-gl644(简称为0Ε: :gl688)。 二、0E::gl688转化出芽短梗霉 将0E: :gl688制成原生质体，然后转化出芽短梗霉，转化后以8mg/mL草按磷为筛 选压力经两次复筛得到OE: : gl688转化子，连续传5代后接种于含有8mg/mL草铵磷的平板 中，0E: :gl688转化子表现出草铵磷抗性。以SEQ ID NO. 11和SEQ ID NO. 12为引物检测 OE: : gl688转化子的gl688基因，检测结果呈阳性。然后提取转化子基因组，进行PCR分析， PCR 分析的引物为：bar.S:5'-tctgcaccatcgtcaaccact_3'（SEQ ID N0.21)，bar.A:5'-ctg ccagaaacccacgtcat-3'（SEQ ID N0.22);退火温度为59°C，延伸时间为35s。结果显不，草 铵磷抗性基因 bar已经整合进入宿主基因组，过表达转化成功。 三、0E: :gl688转化子发酵 将0E: : gl688转化子接种于含葡萄糖90g/L、硫酸铵3g/L、KH2PO4O. 2g/L、 本文档来自技高网...
【技术保护点】
出芽短梗霉二羧酸转运蛋白，其特征在于：所述出芽短梗霉二羧酸转运蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邹祥，冯骏，李正华，李云政，
申请(专利权)人：西南大学，安徽雪郎生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆;85
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