本发明专利技术涉及双抗夹心ELISA定量检测斑马鱼M3a受体蛋白方法，ELISA以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来，敏感性很高。由于抗原、抗体的反应是在聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，保证试验结果的特异性与稳定性。解决现有方法技术中存在的稳定性差、操作复杂的问题。
【技术实现步骤摘要】
本方法属于生命科学领域的技术方法，涉及到双抗夹心ELISA定量检测斑马鱼 M3a。
技术介绍
目前检测M受体蛋白活性的方法主要是放射结合分析法、Western Blotting等。 双抗夹心ELISA主要应用于医疗卫生方面检测各类特异性的抗原。如用于测定牛 朊病毒蛋白，人血液、母乳中的激素含量、草鱼肠型点状产气单胞菌、大熊猫被毛中孕酮含 量等。目前已有双抗夹心ELISA法检测小鼠M3受体水平的试剂盒，但由于抗原抗体的特异 性不能应用于斑马鱼的检测。 目前尚没有明确的方法能对斑马鱼双抗夹心ELISA定量检测斑马鱼M3a受体蛋白 方法受体的蛋白含量进行测定，对双抗夹心ELISA定量检测斑马鱼M3a受体 的测定主要集中在大鼠、小鼠、电鳐这些物种。尚没有检阅到相关文献来检测斑马鱼不同时 间不同浓度环境污染物处理后双抗夹心ELISA定量检测斑马鱼M3a受体的含 量变化，其他生物的监测技术不能用于斑马鱼检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是建立一种双抗夹心ELISA快速定量检测斑马鱼M3a受体蛋白的新 方法，（毒蕈碱型乙酰胆碱受体M受体的其中一个亚型M3a基因序列M3a XM-695289. 6)， ELISA以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合 起来，敏感性很高。由于抗原、抗体的反应是在聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一 种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，保证试验结果的特异性与稳定性。解决 现有方法技术中存在的稳定性差、操作复杂的问题。 为实现上述目的，本专利技术采用如下方案： -种双抗夹心ELISA定量检测斑马鱼M3a，包括如下步骤： 以小鼠M3a受体为抗原，按以下步骤进行处理：包被抗原、洗涤、封闭、洗涤、加一 抗、洗涤、加二抗、洗涤、加显色底物、加显色终止液，用酶标仪测定样品的吸光值450nm以 下，绘制以M3a受体浓度为横坐标，以0D值为纵坐标的标准曲线，建立回归方程；以斑马鱼 蛋白提取物为抗原，按以下步骤进行处理：包被抗原、洗涤、封闭、洗涤、加一抗、洗涤、加二 抗、洗涤、加显色底物、加显色终止液，然后用酶标仪测定样品的吸光值450Nm以下，将吸光 值代入回归方程，得到斑马鱼中M3a受体含量。 优选的是，所述的一抗为针对M3a受体的兔多抗。 优选的是，所述的二抗为HRP标记的羊抗兔lgG。 本专利技术所述的双抗夹心ELISA定量检测斑马鱼M3a的具体步骤如 下： 1)抗体包被：将特异性抗体与固相载体连接形成固相抗体，洗涤除去未结合的抗 体及杂质； 2)加受检样品：让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合 物，洗涤除去其他未结合的物质； 3)加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合；彻底洗涤未结合的 酶标抗体； 4)加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物； 5)终止反应，以标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，生成标准曲线和直线回归 方程式，根据公式计算未知样品的浓度含量。 进一步地，所述抗体包被的具体步骤为：用0. 05M PH9. 6碳酸盐包被缓冲液将纯 化的小鼠单抗稀释；在每个板孔中加0. lml上述稀释液，4°C过夜，弃去孔内溶液，用PBST洗 涤缓冲液洗3-5次，每次3分钟。 进一步地，所述加受检样品的具体步骤为：将稀释后待检样品加入已包被的反应 孔中，封板膜封板后，于22°C孵育30min，然后洗涤；同时设置空白对照孔，不加样品和酶标 试剂，其余步骤相同。 进一步地，所述的待检样品为M3a受体蛋白的标准品和样品蛋白。 进一步地，所述加酶标抗体的具体步骤为：于各反应孔中，加入新鲜稀释的针对 M3a受体的兔多抗0. lml，于22°C孵育30min，洗涤；再加HRP标记的羊抗兔lgG，孵育洗涤。 进一步地，所述加底物的具体步骤为：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶 液0? lml，显色。 进一步地，所述终止反应的方法为：于各反应孔中加入2M硫酸50 y L，液体颜色由 蓝色转为黄色。 -种基于斑马鱼M3a受体蛋白抑制率判断水中溴氰菊酯含量是否超标的方法，其 特征在于，采用权利要求1-9任一所述的方法分别检测污染水体和对照水体中的斑马鱼 M3a受体含量，当斑马鱼M3a受体抑制率低于26. 15%时，则判定水体中溴氰菊酯残留量处 于安全浓度以下，反之，则判定水体中溴氰菊酯残留超标。 本专利技术的有益效果： 本专利技术能够快速的检测斑马鱼中毒蕈碱型乙酰胆碱受体的蛋白含量，能快速测定 斑马鱼暴露在不同浓度环境污染物在不同时间M3a受体的含量变化，灵敏度高、稳定性好、 操作简单。通过该新型方法的建立和优化，能够达到快速定量、操作简单快捷、特异性高、稳 定性好的优点。 本方法所采用的技术方案是采用双抗夹心ELISA法，优化过程主要是对包被抗体 的选择、酶标抗体工作浓度的选择以及孵育温度时间的优化。其中，包被抗体要求纯度高， PH在9. 0-9. 6之间，4°C放置24h。包被的最适浓度和酶标抗体的最适工作浓度均需由滴定 实验确定。 双抗夹心监测斑马鱼不同药物浓度不同时间M3a受体含量变化； 利用药物处理后检测斑马鱼M3a受体的含量变化，从分子方面研宄胆碱能系统的 内在作用机制，再结合本实验室在斑马鱼行为变化方面的研宄，最终应用，于水质实时在 线评估与监测。双抗夹心ELISA监测M3a含量该方法的建立也可为人类相关疾病的研宄提 供相关依据。【附图说明】 图1不同时间不同浓度溴氰菊酯对斑马鱼M3a受体蛋白活性变化的影响 图2双抗夹心ELISA法检测抗原原理图 图3双抗夹心ELISA定量检测M3a受体蛋白流程图 图4不同时间内不同浓度马拉硫磷对斑马鱼mAChR活性变化的影响 图5不同时间不同浓度溴氰菊酯对斑马鱼M3a受体蛋白活性变化的影响 图6生物逐级行为模型【具体实施方式】 一、斑马鱼暴露实验和组织匀浆的获取： l、LC50-48h测定：测定环境污染物对斑马鱼的LC50-48h浓度，以此浓度为一个毒 性单位（ITU)。LC50-48h的测定方法参照国标GB/T 13267-91。2、暴露时设0. 1TU、1TU、2TU三个浓度梯度和对照组（0TU)，设置三个平行。取样时 间：0? 5h、lh、2h、4h、8h、16h、32h、48h。 3、组织勾衆制备：加入预冷PBS，冰浴下充分勾衆，12000rpm/min, 4°C离心20min 后取上清。 二、蛋白总量测定：以BSA为标准，Bradford法测样品的蛋白含量。 三、双抗体夹心ELISA法测定M3a受体的含量 1、包被：用0. 05M PH 9. 6碳酸盐包被缓冲液将纯化的小鼠单抗稀释至一定浓度。 在每个板孔中加〇. lml，4°C过夜。次日，弃去孔内溶液，用PBST洗涤缓冲液洗3-5次，每次 3分钟。 2、加样：加一定稀释的待检样品（即M3a受体蛋白的标准品和样品蛋白）0. lml于 已包被的反应孔中，封板膜封板后置22°C孵育30min，然后洗涤。同时设置空白对照孔，不 加样品和酶标试剂，其余步骤相同。 3、加兔多抗：于各反应孔中，加入新鲜稀释的针对M3a受体的兔多抗（经滴定后的 稀释度）〇. lml。22°C孵育30min，洗涤。 4、加HRP标记的羊抗兔l本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种双抗夹心ELISA定量检测斑马鱼M3a受体蛋白方法，其特征在于：包括如下步骤：以小鼠M3a受体为抗原，按以下步骤进行处理：包被抗原、洗涤、封闭、洗涤、加一抗、洗涤、加二抗、洗涤、加显色底物、加显色终止液，用酶标仪测定样品的吸光值450nm以下，绘制以M3a受体浓度为横坐标，以OD值为纵坐标的标准曲线，建立回归方程；以斑马鱼蛋白提取物为抗原，按以下步骤进行处理：包被抗原、洗涤、封闭、洗涤、加一抗、洗涤、加二抗、洗涤、加显色底物、加显色终止液，然后用酶标仪测定样品的吸光值450nm以下，将吸光值代入回归方程，得到斑马鱼中M3a受体含量。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：任宗明，司桂云，李尚戈，王洵，齐丽，
申请(专利权)人：山东师范大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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