一种木聚糖酶的制备方法技术

本发明专利技术涉及微生物发酵和酶工程技术领域，尤其涉及一种毕赤酵母工程菌发酵生产的饲用木聚糖酶的制作方法。本发明专利技术的目的是提供一种木聚糖酶的制备方法，包括：活化菌种；扩大培养；二次扩大培养；发酵；过滤；超滤浓缩；加入防腐剂混合均匀，精滤，除菌，灌装。通过选择合适的pH、发酵时间和培养基提高酶的产量以及使酶具有更好的耐热性，且发酵时间缩短，利于工业化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物发酵和酶工程
，尤其涉及一种毕赤酵母工程菌发酵生 产的饲用木聚糖酶的制备方法。
技术介绍
木聚糖酶是指可将木聚糖降解成低聚糖和木糖的一组酶的总称，它是一种存在于 植物细胞壁中的异质多糖，约占细胞干重的15%_35%，主要分解由五碳糖聚合而成的半纤维 素、木聚糖成为五碳糖，如木糖、木二糖、木三糖和少量的阿拉伯糖，是饲料主要用酶之一， 木聚糖酶是市场上应用最广泛的单酶制剂之一，而且也是绝大多数饲用复合酶制剂的主要 组成成分。 木聚糖酶在饲料、食品、纺织、造纸和日用化工等行业都有着极其广泛的用途。在 饲料工业中，木聚糖酶可提高单胃动物的饲料利用率，促进动物生长；在造纸工业中应用酶 前处理工艺可以使木质素提取变得更容易，同时保留纤维素成分，这样使得在随后的工艺 中减少化学漂白剂的用量，达到既环保又经济的目的；木聚糖应用于小麦食品，通过改善面 团的持水性和面筋结构进而改善其品质，并延长其货架期等；上述事实说明木聚糖酶的市 场容量很大。目前国内生产木聚糖酶的厂家较少，酶活力单位较低，质量不稳定，木聚糖酶 产品主要依靠进口。 目前大多数木聚糖酶的最适温度在40-60°C之间。由于酶在饲料、工业生产、食品 加工过程中要经受高温高湿工序，如制粒等，饲用酶还要经受胃酸和胃蛋白酶的损害，这就 要求相应酶种具有良好的耐热性。现有技术中制备木聚糖酶发酵时间过长，而且容易引起 产量的下降。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种产率高、耐热性好的木聚糖酶的制备 方法。 ，包括如下步骤： 活化菌种：用Yro培养基对毕赤酵母工程菌进行活化，活化条件为30°C，20-24h ; 扩大培养：将活化好的菌种接入摇瓶中，于30°C下，以180-220r/min的转速进行扩大 培养； 二次扩大培养：22-24h后接入种子罐，30°C条件下进一步扩大培养； 发酵：经种子罐扩大培养后，接入发酵罐，30°C下，pH4. 8-5. 1条件下进行发酵，140h 后发酵结束； 过滤：将发酵结束的料液，加入1%的硅藻土，混合均匀后，打入板框压滤机进行过滤， 过滤压力〈〇· 5MPa ; 超滤浓缩：过滤澄清后，用膜分子量1000 ODa的有机膜进行超滤浓缩，浓缩至所需要的 酶活； 加入防腐剂盐和山梨酸钾，盐的浓度为10%，山梨酸钾的浓度为2%。。加入量为本领域 常规技术手段，例如，质量比为1:1-1:10加入。 加入上述的防腐剂后，与滤液混合均匀，在小于0. 5Mpa的压力下，精滤、除菌，灌 装。 所述扩大培养的培养基是Yro培养基。 所述Yro培养基是：酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%。 所述二次扩大培养的培养基是：碳源5-7%，氮源0. 5-3%，硫酸镁0. 5-1. 0%，硫酸钾 0. 5-1. 0%，磷酸二氢钾0. 2-0. 6% ;优选碳源7%，氮源2%，硫酸镁0. 8%，硫酸钾0. 5%，磷酸二 氢钾0. 3%。 所述二次扩大培养基的碳源优选甘油，氮源优选磷酸二氢铵。 所述发酵的条件是30°C下，pH4. 8-5. 1进行发酵，所述pH优选5. 0。 所述发酵的培养基是：甲醇10-20%，氨水1-2%、磷酸二氢钾0. 7%、七水合硫酸镁 0.03%、硫酸钙0.05%、硫酸钾0.05%，葡萄糖10%。 所述甲醇的浓度优选15%，氨水优选1 · 5% 所述的发酵时间120-140小时。 本专利技术研宄中对发酵过程的甲醇用量进行筛选，研宄发现，获得木聚糖酶较现有 技术产量大幅提高；同时，通过各阶段培养基成分的研宄筛选，发现所述方法制得的木聚糖 酶与现有木聚糖酶相比具有更好的耐热性，同时产率获得保障，发酵时间也大幅缩短，特别 适合工业化生产，能够有效提高产品效率。本专利技术的木聚糖酶在温度90°C，相对酶活均可保 持85%以上；而现有木聚糖酶在温度30-70°C范围内，相对酶活只保持60%。【具体实施方式】 下面结合结合具体实施例对本专利技术作进一步的描述，但本专利技术的保护内容不仅限 于这些实施例。 酶活性的测定方法为：准确移取3mL缓冲液于IOOmL容量瓶中，将其浸没在不同温 度的水浴锅中（90°C )，预热5min，再准确称取2. 50g木聚糖酶倒入容量瓶，摇匀，湿热处理 3min，测定其剩余酶活，并计算在不同处理条件下木聚糖酶的相对剩余酶活性。 实施例1 活化菌种：用YH)培养基对毕赤酵母工程菌(保藏号：CCTCC，N〇:M205033)进行活化，活 化条件为30°C，22h ; 扩大培养：将活化好的菌种接入摇瓶中，于30°C下，以220r/min的转速进行扩大培养， 扩大培养所用的培养基是YH)培养基； 二次扩大培养：22h后接入种子罐，30°C条件下进一步扩大培养，二次扩大的培养基 是：甘油7%，磷酸二氢铵2%，硫酸镁0. 8%，硫酸钾0. 5%，磷酸二氢钾0. 3% ; 发酵：经种子罐扩大培养后，接入发酵罐，30°C下，pH 5.0条件下进行发酵，120h后发 酵结束，发酵培养基是：甲醇15%，氨水1.5%、磷酸二氢钾0.7%、七水合硫酸镁0.03%、硫 酸钙0.05%、硫酸钾0.05%，葡萄糖10%; 过滤：将发酵结束的料液，加入1%的硅藻土，混合均匀后，打入板框压滤机进行过滤， 过滤压力发酵〈〇· 5MPa ; 超滤浓缩：过滤澄清后，用膜分子量1000 ODa的有机膜进行超滤浓缩，浓缩至所需要的 酶活； 加入防腐剂盐和山梨酸钾，盐的浓度为10%，山梨酸钾的浓度为2%。。 加入上述的防腐剂后，与滤液混合均匀，在小于0. 5Mpa的压力下，精滤、除菌，灌 装，所得酶产率是85%，相对酶活约90%。 实施例2 按照实施例1的方法制备木聚糖酶，研宄二次扩大培养的培养基中碳源、氮源的种类 及各组分的浓度对木聚糖酶的产率和相对酶活的影响。其余培养环境不变，分别单独改变 二次扩大培养基中碳源、氮源的种类、各组分的浓度，结果如下表所示： 表1实施例3 按照实施例1的方法制备木聚糖酶，研宄发酵阶段pH、发酵时间和甲醇浓度对木聚糖 酶的产率和相对酶活的影响。其余培养环境不变，分别单独改变PH、发酵时间、甲醇浓度和 氨水浓度，结果如下表所示： 表2【主权项】1. ，包括下述步骤： 活化菌种：用Yro培养基对毕赤酵母工程菌进行活化，活化条件为30°C，20-24h; 扩大培养：将活化好的菌种接入摇瓶中，于30°C下，以180-220r/min的转速进行扩大 培养，扩大培养的培养基是YH)培养基； 二次扩大培养：22-24h后接入种子罐，30°C条件下进一步扩大培养，二次扩大培养 的培养基是：碳源5-7%，氮源0. 5-3%，硫酸镁0. 5-1. 0%，硫酸钾0. 5-1. 0%，磷酸二氢钾 0. 2-0. 6% ； 发酵：经种子罐扩大培养后，接入发酵罐，30 °C下，pH4. 8-5. 1条件下进行发酵， 120h-140h后发酵结束，发酵的培养基是：甲醇10-20%，氨水1-2%、磷酸二氢钾0. 7%、七水 合硫酸镁〇. 03 %、硫酸钙0. 05 %、硫酸钾0. 05 %，葡萄糖10% ; 过滤：将发酵结束的料液，加入1%的硅藻土，混合均匀后，打入板框压滤机进行过滤， 过滤压力〈〇? 5MPa;本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种木聚糖酶的制备方法，包括下述步骤：活化菌种：用YPD培养基对毕赤酵母工程菌进行活化，活化条件为30℃,20‑24h；扩大培养：将活化好的菌种接入摇瓶中，于30℃下，以180‑220r/min的转速进行扩大培养，扩大培养的培养基是YPD培养基；二次扩大培养：22‑24h后接入种子罐，30℃条件下进一步扩大培养，二次扩大培养的培养基是：碳源5‑7%，氮源0.5‑3%，硫酸镁0.5‑1.0%，硫酸钾0.5‑1.0%，磷酸二氢钾0.2‑0.6%；发酵：经种子罐扩大培养后，接入发酵罐，30℃下， pH4.8‑5.1条件下进行发酵，120h‑140h后发酵结束，发酵的培养基是：甲醇10‑20%，氨水1‑2％、磷酸二氢钾0.7％、七水合硫酸镁0.03％、硫酸钙 0.05％、硫酸钾0.05％，葡萄糖10%；过滤：将发酵结束的料液，加入1%的硅藻土，混合均匀后，打入板框压滤机进行过滤，过滤压力<0.5MPa；超滤浓缩：过滤澄清后，用膜分子量10000Da的有机膜进行超滤浓缩，浓缩至所需要的酶活；加入防腐剂盐和山梨酸钾，盐的浓度为10%，山梨酸钾的浓度为2‰；加入上述的防腐剂后，与滤液混合均匀，在小于0.5Mpa的压力下，精滤、除菌，灌装。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：唐亚军，
申请(专利权)人：唐亚军，
类型：发明
国别省市：江苏;32