一种携带恒河猴抵抗素剪接体基因慢病毒载体的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种携带恒河猴抵抗素剪接体基因慢病毒载体的构建方法，运用普通PCR直接同时扩增抵抗素全长和剪接体基因，用胶回收方法直接回收剪接体条带，然后进行载体的快速克隆测序；使用慢病毒载体高效转染试剂转染所有慢病毒载体质粒，并使用灭活血清包装慢病毒颗粒，并获得高滴度的重组慢病毒原液。本发明专利技术可免去PCR+1方法筛选大量的工作和高额的费用，消除获得剪接体基因的概率限制，并高效、快速、廉价地直接获得剪接体基因；可高效转染慢病毒载体质粒，并获得高滴度的重组慢病毒滴度。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于克隆
，尤其涉及。
技术介绍
抵抗素是新发现的一种脂肪组织特异性分泌的脂肪细胞因子，具有抵抗胰岛素的作用，认为是肥胖与II型糖尿病之间未曾被发现的联系纽带，甚至认为肥胖能引起胰岛素抵抗就是因为脂肪细胞分泌了抵抗素的缘故。抵抗素的发现是糖尿病研宄中的一大进展，已成为连接肥胖与II型糖尿病相关性的研宄热点。但是近几年的研宄结果对抵抗素参与机体胰岛素抵抗的生物学功能的阐述发生了分歧，在对人类II型糖尿病群体的统计分析中甚至出现了没有相关性的结果，大部分科学研宄者推测这很可能是实验动物的物种不同造成的原因，同时近期在人类中发现了有抵抗素剪接体的存在，目前我们的研宄团队也发现非人灵长类恒河猴也有抵抗素剪接体的存在，而且恒河猴抵抗素剪接体的剪接位点和片段大小与人类的完全一致，或许这是在部分人类II型糖尿病群体中抵抗素生物学功能研宄结果出现不同结果的原因所在。因为非人灵长类恒河猴在遗传和生理生化上都与人类存在较高的相似性，因此克隆恒河猴抵抗素剪接体基因是研宄人类抵抗素剪接体基因比较医学功能的理想选择。另外，慢病毒载体能有效介导外源基因在细胞或机体组织内稳定表达，可长期持续性表达目的蛋白，是目前将外源基因导入细胞内稳定表达的较好的工具。所以，构建恒河猴抵抗素剪接体的重组慢病毒载体，对人类抵抗素剪接体的生物学功能的研宄，具有重要的比较医学意义。剪接体的克隆方法，通常情况用PCR+1的方法对目的基因的等位基因进行随机克隆筛选，通过对大量单克隆菌的测序和筛选，分析等位基因，筛选出剪接体。一般情况，对慢病毒载体的构建过程中包装慢病毒颗粒采用脂质体转染试剂进行质粒转染，并用含丙酮酸钠的病毒包装培养基进行包装颗粒。用一般的方法进行慢病毒包装，存在质粒转染效率低、慢病毒滴度不高等不足，尤其是滴度不高一直是困扰慢病毒载体运用的一大问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供，旨在解决用PCR+1方法筛选工作量大、费用高昂，传统的方法进行慢病毒包装，存在质粒转染效率低、慢病毒滴度不高的问题。本专利技术是这样实现的，包括:步骤一、运用普通PCR直接同时扩增抵抗素全长和剪接体基因，用胶回收方法直接回收剪接体条带，然后进行载体的快速克隆测序；步骤二、使用慢病毒载体高效转染试剂转染所有慢病毒载体质粒，并使用灭活血清包装慢病毒颗粒，并获得高滴度的重组慢病毒原液；进一步，携带恒河猴抵抗素剪接体基因慢病毒载体的构建方法具体包括:步骤一、设计恒河猴抵抗素ORF扩增引物，分别携带PLV-EFla-EGFP Puro质粒的酶切位点 EcoR I 和 BamH I，h游引物 5’ -GGAATTCCACCATGAAAGCCCTCTGTCTCCTCCT-3’ (EcoR I )，下游引物 5’ -CGGGATCCCGTCAGGGCTGCAGACGACAGCAGC-3’ (BamH I )；步骤二、恒河猴抵抗素剪接体的PCR扩增，包括RNA提取、cDNA合成、恒河猴抵抗素剪接体的PCR扩增；步骤三、恒河猴抵抗素剪接体慢病毒载体的构建，将纯化后测序正确的246bp大小的PCR产物和PLV-EFla-EGFPPuro质粒分别进行酶切，用2%的琼脂糖凝胶电泳，分别回收酶切产物，将酶切产物16°C过夜连接，将连接产物培养过夜，次日挑取培养板上的单克隆菌至5mL AMP+LB培养液试管中，37°C摇菌过夜；步骤四、提取重组质粒；步骤五、将酶切鉴定和测序正确的恒河猴抵抗素剪接体PLV-EFla-EGFPPuro重组质粒、PHl和PH2包装质粒在Stbl 3感受态细胞中转化扩增，提取质粒，并用微量分光光度计测定各质粒浓度；步骤六、转染前2d将293T细胞接种到1cm圆碟中，用高糖DMEM完全培养基培养，待细胞单层长至70%即可开始转染慢病毒系统质粒。进一步，转染慢病毒系统质粒的具体方法为:先将5 μ g的恒河猴抵抗素剪接体PLV-EFla-EGFP Puro重组质粒加入500 μ LOpt1-MEM中，再加入3.75 μ g的HPl质粒和1.25 μ g的PH2质粒，轻轻混匀，静置5min ;在另一只管中将20 μ L的EndoFectin Lenti慢病毒高效转染试剂加入480 μ L Opt1-MEM中混匀；再将稀释转染试剂的后一只管中的混合液缓慢加入前一管中轻轻混匀，并在室温静置孵育20min。然后把293T包装细胞的培养基小心更换为1mL慢病毒包装培养液，再将ImL转染混合液均匀加入293T细胞培养液中，37°C培养8h后更换为1mL新鲜的慢病毒包装培养液，在转染48h后在荧光显微镜下观察eGFP载体报告基因的转染效率，并收获重组病毒原液。本专利技术可免去PCR+1方法筛选大量的工作和高额的费用，消除获得剪接体基因的概率限制，并高效、快速、廉价地直接获得剪接体基因；可高效转染慢病毒载体质粒，并获得高滴度的重组慢病毒滴度。【附图说明】图1是本专利技术实施例提供的恒河猴抵抗素剪接体PCR扩增电泳图；图2是本专利技术实施例提供的恒河猴抵抗素ORF和剪接体序列比对结果；图3是本专利技术实施例提供的恒河猴抵抗素剪接体重组慢病载体质粒的双酶切鉴定结果；图4是本专利技术实施例提供的感染恒河猴抵抗素剪接体重组慢病毒的KMB17细胞cDNA的RT-PCR检测结果。【具体实施方式】为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。下面结合附图及具体实施例对本专利技术的应用原理作进一步描述。1、试验材料和试剂质粒、菌株及细胞:PLV-EFla-EGFP Puro/PHl/PH2慢病毒系统购于英茂盛业公司，感受态DH5 α (中国医学科学院医学生物学研宄所保存)，感受态Stbl3购于GeneCopoeia公司，293T细胞和KMB17细胞(中国医学科学院医学生物学研宄所保存)。主要试剂:TRIzol Reagent 购于美国 invitroger 公司，PCR master mix、内切酶 EcoR I 和BamH 1、T4连接酶均购于TAKARA公司，胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购于Omega公司，DMEM和FBS购于康宁公司，Opt 1-MEM购于GIBCO公司，Polybrene购于Sigma公司，转染试剂EndoFectin-Lenti和cDNA逆转录试剂盒购于GeneCopoeia公司。2、引物设计与合成根据NCBI JF740676.1报道序列设计恒河猴抵抗素ORF扩增引物，分别携带PLV-EFla-EGFP Puro 质粒的酶切位点 EcoR I 和 BamH I，h游引物 5’-GGAATTCCACCATGAAAGCCCTCTGTCTCCTCCT-3’(EcoR I )，下游引物 5 ’ -CGGGATCCCGTCAGGGCTGCAGACGACAGCAGC-3’ (BamH I )。并送由上海生工合成引物。3、恒河猴抵抗素剪接体的PCR扩增3.1RNA 提取在正常饲养恒河猴群中随机采集4只恒河猴的后肢静脉抗凝血，分别取200 μ L放入1.5mL的无RNA酶离心管，加入800 μ L的TRIzol Reagent溶液，漩涡振荡充分混匀；再加入200本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种携带恒河猴抵抗素剪接体基因慢病毒载体的构建方法，其特征在于，所述的携带恒河猴抵抗素剪接体基因慢病毒载体的构建方法包括：步骤一、运用普通PCR直接同时扩增抵抗素全长和剪接体基因，用胶回收方法直接回收剪接体条带，然后进行载体的快速克隆测序；步骤二、使用慢病毒载体高效转染试剂转染所有慢病毒载体质粒，并使用灭活血清包装慢病毒颗粒，并获得高滴度的重组慢病毒原液。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：鲁帅尧，马开利，乞素冬，李鸿钧，和占龙，马进，陈瑜，吴正存，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学生物学研究所，
类型：发明
国别省市：云南;53