本发明专利技术公开了一种Decoy核酸阳离子脂质体载体的制备方法，它包括如下步骤：(1)将二油酰磷脂酰乙醇胺和(2，3-二油酰基-丙基)-三甲胺按质量比4∶1～1∶4混合，加入有机溶剂溶解得到混合溶液；(2)将步骤(1)得到的混合溶液完全蒸干有机溶剂，使用HEPES缓冲液溶解剩余的固体部分，先水合30～60min，再超声30～60min；(3)将步骤(2)处理后得到的混合体系先过0.4～0.8μm的膜，再过0.03～0.2μm的膜，制备粒径小、分布均匀的空白脂质体；(4)将空白脂质体与鱼精蛋白、Decoy核酸按照质量比(50～120)∶(10～20)∶1混合，2℃～8℃孵育12～24小时形成完整的Decoy核酸阳离子脂质体载体。本发明专利技术的Decoy核酸阳离子脂质体载体具有较高的入膜率高和入核率，同时不具有细胞毒性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于药物制剂
，具体涉及一种Decoy核酸阳离子脂质体载体及其 制备方法。
技术介绍
脂质体是由磷脂双分子定向排列而成的直径几纳米至几微米的超细粒子，双分子 层内外分别包封脂溶性和水溶性药物。脂质体具有能使药物具有靶向性、提高和延长疗效、 缓和毒性、避免耐药性和改变给药途径等特点。自20世纪60年代Rahman等人首次将脂质 体作为药物载体应用以来，关于脂质体的制备工艺，作用机制，体内分布，药理毒理等特性 研宄不断深入。 脂质体按照所带电荷特性可分为中性脂质体、正电性脂质体和负电性脂质体。由 于脂质体具有类似生物膜的结构，安全性高，而且可以长时间吸附在靶细胞周围，促进药物 的渗透与吸收，并可能经融合作用进入细胞内后再释放药物，同时可以较为容易的连接特 异性配体而获得主动靶向性效果，因此脂质体作为药物载体在恶性肿瘤的靶向给药治疗方 面极具潜力，具有能增加与癌细胞的亲和力，克服耐药性，增加癌细胞对药物的摄取量，减 少用药剂量，提高疗效，较少毒副作用的特点。现有的针对脂质体的研宄主要停留在如何利 用脂质体将目标物运输到细胞内，在提高脂质体稳定性和包封率的同时，降低细胞毒性。 入核困难是长期以来困扰Decoy核酸药物的技术问题。Decoy核酸药物能够以转 录因子为靶点从转录水平上调控基因表达，是一种靶向性强的新型药物，其主要存在问题 是由于decoy药物所作用的靶位点转录因子多存在于细胞核内，因此需要药物输送系统携 带药物穿透细胞膜与细胞核。现有技术中关于协助药物进入细胞核的脂质体还未见报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种Decoy核酸阳离子脂质体载体，以提高转 染细胞时的入膜率和入核率。 本专利技术还要提供上述Decoy核酸阳离子脂质体载体的制备方法。 为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下： -种Decoy核酸阳离子脂质体载体的制备方法，它包括如下步骤： (1)将DOPE (二油酰磷脂酰乙醇胺）和DOTAP ((2, 3-二油酰基-丙基）-三甲胺） 按质量比4 : 1~1 : 4混合，加入有机溶剂溶解得到混合溶液； (2)将步骤（1)得到的混合溶液完全蒸干有机溶剂，使用HEPES缓冲液溶解剩余的 固体部分，水合30~60min，水合结束后超声30~60min ; (3)将步骤⑵处理后得到的混合体系先过0.4~0.8 μπι的膜，再过0.03~ 〇. 2 μL?的膜，制备粒径小分布均匀的空白脂质体； (4)将空白脂质体与鱼精蛋白、Decoy核酸按照质量比（50~120) : (10~ 20) : 1混合，2°C~8°C孵育12~24h形成完整的Decoy核酸阳离子脂质体载体。 步骤（1)中，所述的有机溶剂为三氯甲烷。 步骤⑴中，每毫克二油酰磷脂酰乙醇胺和（2,3_二油酰基-丙基）_三甲胺的混 合物中加入IOml有机溶剂。 步骤（2)中，蒸干有机溶剂的方法是使用旋转蒸发器蒸干。 优选地，步骤⑵中，所述的HEPES缓冲液为3~5mol/L pH 7. 4的HEPES缓冲液。 优选地，步骤（2)中，水合温度为20°C~30°C，超声功率为100~200W。 步骤⑶中，所述的膜为聚碳酸酯膜，混合体系先过0.4~0.8μπι的膜10~20 次，再过〇· 03~0· 2 μ m的膜10~20次。 上述制备方法制备得到Decoy核酸阳离子脂质体载体也在本专利技术的保护范围之 内。 上述Decoy核酸阳离子脂质体载体在作为携带药物穿透细胞膜和细胞核的药物 输送系统中的应用也在本专利技术的保护范围之内。 有益效果：本专利技术与目前市面上最常用的转染试剂lip〇2000相比，在使用 hek293作为转染细胞时，入膜率提高了 30%，入核率提高了 90% ;与市面转染效率最好的 lip〇3000相比转染效果基本持平，同时不具有细胞毒性。【附图说明】 图I :A为DOPE结构，B为DOTAP结构示意图。 图2 :核酸：LMWP :脂质体复合物示意图，其中，A为脂质体层，B为DNA，C为LMWP ; dDNA为两DNA分子轴间距，δ w为脂质层厚度，δ m为DNA分子厚度； 图3A为实施例1阳离子脂质体平均粒径检测图； 图3B为实施例1阳离子脂质体zeta电位的检测结果图； 图4A为I ipo2000转染效果图； 图4B为I ipo3000转染效果图； 图4C为含250ngDNA Decoy核酸阳离子脂质体转染效果图； 图4D为含500ngDNA Decoy核酸阳离子脂质体转染效果图； 图4E为含1000 ngDNA Decoy核酸阳离子脂质体转染效果图； 图5A为lipo2000入核效果图； 图5B为lipo3000入核效果图； 图5C为含250ngDNA Decoy核酸阳离子脂质体入核效果图； 图为含500ngDNA Decoy核酸阳离子脂质体入核效果图； 图5E为含1000 ngDNA Decoy核酸阳离子脂质体入核效果图。【具体实施方式】 根据下述实施例，可以更好地理解本专利技术。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的内容仅用于说明本专利技术，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本 专利技术。 实施例1制备Decoy核酸阳离子脂质体。 (1)取DOPE、DOTAP各3mg，溶于20ml三氯甲烷中制成脂质溶液； (2)将上述脂质溶液加入圆底烧瓶中，在20°C恒温水浴中旋转减压蒸发，注意转 速与温度的调节避免产生气泡，去除有机溶剂，形成脂膜，取3ml 4mM pH 7.4 HEPES加入 上述圆底烧瓶中，20°C水合30min，水合后再超声30min，超声功率为100W，制成粗脂质体溶 液；将粗脂质体溶液经过〇. 4 μ m膜10次，然后经过0. 2 μ m膜10次制成2mg/ml脂质体溶 液。 (3)取鱼精蛋白2mg，Decoy核酸lmg，分别溶于Iml 4mM pH 7. 4 HEPES缓冲液中 制成鱼精蛋白和Decoy核酸溶液。 (4)取 I. 5ml 印pendorf 试管，在其中按顺序加入 670 μ I 4mM pH7. 4 HEPES 缓冲液，275 μ 1脂质体溶液，50 μ I LMWP溶液，5 μ I Decoy核酸溶液形成质量比 110 : 20 : IDecoy核酸阳离子脂质体混合溶液，4°C冰箱中静止孵育12h，得到Decoy核酸 阳离子脂质体。 制备的Decoy核酸阳离子脂质体经粒度分析仪检测和Zeta电位仪检测，检测结果 如图3A和图3B所示，平均粒径为200nm，zeta电位为38. 45mV。 实施例2制备Decoy核酸阳离子脂质体。 (1)取DOPE、DOTAP各3mg，溶于20ml三氯甲烷中制成脂质溶液； (2)将上述脂质溶液加入圆底烧瓶中，在20°C恒温水浴中旋转减压蒸发，注意转 速与温度的调节避免产生气泡，去除有机溶剂，形成脂膜，取3ml 4mM pH 7.4 HEPES加入 上述圆底烧瓶中，20°C水合30min，水合后再超声30min，超声功率为100W，制成粗脂质体溶 液；将粗脂质体溶液经过〇. 4 μ m膜10次，然后经过0. 2 μ m膜10次制成2mg/ml脂质体溶 液。 (3)取鱼精蛋白2mg，Decoy核酸lmg，分本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种Decoy核酸阳离子脂质体载体的制备方法，其特征在于，它包括如下步骤：(1)将二油酰磷脂酰乙醇胺和(2，3‑二油酰基‑丙基)‑三甲胺按质量比4∶1～1∶4混合，加入有机溶剂溶解得到混合溶液；(2)将步骤(1)得到的混合溶液完全蒸干有机溶剂，使用HEPES缓冲液溶解剩余的固体部分，先水合30～60min，再超声30～60min；(3)将步骤(2)处理后得到的混合体系先过0.4～0.8μm的膜，再过0.03～0.2μm的膜，制备粒径小、分布均匀的空白脂质体；(4)将空白脂质体与鱼精蛋白、Decoy核酸按照质量比(50～120)∶(10～20)∶1混合，2℃～8℃孵育12～24小时形成完整的Decoy核酸阳离子脂质体载体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：肖扬，崔进龙，李正荣，叶青，何凌云，王雪根，
申请(专利权)人：南京凯基生物科技发展有限公司，南京艾德凯腾生物医药有限责任公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。