Sirt1-Nrf2新抗氧化通路在氧化损伤治疗中应用的实验方法技术

本发明专利技术公开了一种Sirt1-Nrf2新抗氧化通路在氧化损伤治疗中应用的实验方法，包括体外实验和体内试验，体外实验结果显示氧化应激状态下，Nrf2蛋白稳定性、蛋白表达量下降，乙酰化水平增高；氧化应激状态下，Sirt1蛋白和基因表达水平均显著下降。体内实验结果显示氧化损伤情况下，Nrf2和Sirt1表达均明显下降；Sirt1激活剂能够上调Nrf2水平，增加机体抗氧化分子表达，并减低氧化性肺损伤；上调Sirt1基因表达能够增加机体抗氧化分子表达，减低氧化性肺损伤。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医学研宄领域，尤其涉及一种Sirtl-Nrf2新抗氧化通路在氧化损伤 治疗中应用的实验方法。
技术介绍
机体氧化和抗氧化失衡所导致的氧化损伤是衰老和疾病发生的核心机制。已经 证实，包括急性冠脉综合征、糖尿病、肝硬化以及中毒等急慢性疾病的发生均与氧化损伤有 关。有鉴于此，内外许多学者试图采用补充超氧化物歧化酶（SOD)、维生素 C、维生素 E、谷光 甘肽、退黑素等抗氧化物治疗氧化性损伤。然而，外源性抗氧化物分子量大，较难透过细胞 膜进入细胞内，且迅速被代谢，所以无法真正有效的纠正细胞内氧化-抗氧化失衡状态，其 对机体氧化性损伤的治疗亦达不到预期效果。 核因子 E2 相关因子 2 转录因子（nuclear factor E2_related factor-2，Nrf2) 属于Cap' n' Collar家族，是调节细胞内众多抗氧化物表达的关键性因子。生理条件 下，Nrf2在细胞质中与Keapl结合处于非活化、易降解的状态。在氧化应激原作用后（如 毒物、吸烟、损伤等），Nrf2转录因子与Keapl解离活化进入细胞核，并与抗氧化反应元件 ARE(antioxidant response element)结合，启动下游的II相解毒酶、抗氧化蛋白等基因 转录和表达，增加细胞对氧化损伤的抗性。Mercado等研宄发现，去乙酰化酶抑制剂能够显 著抑制氧化应激后Nrf2蛋白表达和活性，下游抗氧化分子的表降低，提示去乙酰化在维持 Nrf2蛋白的稳定性和活性中起着重要的作用。沉默信息调节因子I (silent information regulator l，Sirtl)是NAD依赖的去乙酰化酶，可以与转录因子及转录因子共调节因子相 互作用，通过去乙酰化作用调节靶蛋白活性、基因转录。有鉴于此，深入了解氧化应激情况 下Nrf2乙酰化状态，分析Sirtl-Nrf2抗氧化效应，对于氧化损伤相关疾病的治疗具有重要 意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种Sirtl-Nrf2新抗氧化通路在氧化损伤治疗中应用的 实验方法，旨在深入了解氧化应激情况下Nrf2乙酰化状态，分析Sirtl-Nrf2抗氧化效应。 本专利技术是这样实现的，一种Sirtl-Nrf2新抗氧化通路在氧化损伤治疗中应用的 实验方法包括体外实验和体内试验； 所述的体外实验包括： 步骤一、小鼠 AEC-II的分离纯化； 步骤二、小鼠肺泡II型上皮细胞的鉴定； 步骤三、RT-PCR检测PQ暴露小鼠 AEC-II中Sirtl、Nrf2基因表达改变与PQ作用 的时间、剂量效应关系； 步骤四、Western-bolt法检测PQ暴露小鼠 AEC-II中Sirtl、Nrf2蛋白表达改变 与PQ作用的时间、剂量效应关系； 步骤五、免疫沉淀法检测PQ暴露小鼠 AEC-IINrf2的乙酰化水平； 步骤六、化学比色法检测SOD、CAT、GSH、MDA ; 步骤七、ELISA检测HO-I表达； 步骤八、CO-IP法检测Sirtl与Nrf2蛋白之间的相互作用； 所述的体内实验包括： 步骤一、小鼠原代MSC提取与培养； 步骤二、BMSC的免疫荧光鉴定； 步骤三、慢病毒转染BMSC细胞； 步骤四、PQ中毒小鼠实验分组及模型建立； 步骤五、PRC法、Western-blot法检测Nrf2、Sirtl蛋白的表达情况； 步骤六、化学比色法检测MDA、SOD、GSH、CAT改变； 步骤七、ELISA 法检测 IL-I β、TNF- a、IL-10、TGF- β 1 蛋白含量； 步骤八、肺组织损伤的检测。 进一步，所述的RT-PCR检测PQ暴露小鼠 AEC-II中Sirtl、Nrf2基因表达改变与 PQ作用的时间、剂量效应关系中的PCR引物为： Sirtl，上游序列为 5' -acgctgtggcagattgttatta-3'，下游序列为 5? -ttgaagaatggtcttgggtctt~3,； Nrf2，上游序列为 5' -attctttcagcagcatcctctc-3'，下游序列为 5? -acacttccaggggcactatcta-3,； β-actin，上游序列为 5' -atatcgctgcgctggtcgtc-3'，下游序列为 5, _aggatggcgtgagggagagc_3,。 进一步，所述的PQ中毒小鼠实验分为8组：空白对照组、NS组、PQ组、PQ+NS组、 PQ+LV-MSC-GFP 组、PQ+LV-MSC-Nrf2 组、PQ+LV-MSC-Sirtl 组、PQ+LV-MSC-Nrf2/Sirtl 组； 每组小鼠的处理如下： 实验前动物禁食8h，禁水4h ; PQ+LV-MSC-Nrf2/Sirtl组：经左侧腹腔注射20% PQ溶液，染毒后Imin内经尾静 脉注射浓度为IOX IO6Ail LV-MSC-Nrf2细胞悬液和LV-MSC-Sirl细胞悬液各0. 05ml ; PQ+LV-MSC-Nrf2组：经左侧腹腔注射20 % PQ溶液，染毒后Imin内经尾静脉注射 浓度为 5 X l〇7ml LV-MSC-Nrf2 细胞悬液 0.1 ml ; PQ+LV-MSC-Sirtl组：经左侧腹腔注射20% PQ溶液，染毒后Imin内经尾静脉注射 浓度为 5 X l〇7ml LV-MSC-Sirtl 细胞悬液 0.1 ml ; PQ+LV-MSC-GFP组：经左侧腹腔注射20% PQ溶液，染毒后Imin内经尾静脉注射浓 度为 5 X 106ml LV-MSC-GFP 细胞悬液 0.1 ml ; PQ+生理盐水组：经左侧腹腔一次性注射20% PQ溶液，染毒后Imin内经右侧腹腔 注射； PQ组：经左侧腹腔注射20 % PQ溶液； NS组：经左侧腹腔注射等体积的生理盐水； 空白对照组：未给予任何处理。【附图说明】 图1是本专利技术实施例提供的Sirtl_Nrf2新抗氧化通路在氧化损伤治疗中应用的 体外实验的方法流程图； 图2是本专利技术实施例提供的Sirtl-Nrf2新抗氧化通路在氧化损伤治疗中应用的 体内试验的方法流程图； 图3是本专利技术实施例提供的Sirtl、Nrf2蛋白表达水平图； 图4是本专利技术实施例提供的Sirtl、Nrf2蛋白的相对表达量图； 图5是本专利技术实施例提供的PQ刺激小鼠 AEC-II HO-I改变图。【具体实施方式】 为能进一步了解本专利技术的
技术实现思路
、特点及功效，兹例举以下实施例，并配合附图 详细说明如下：本专利技术不存在软件或方法的创新。 本专利技术是这样实现的，一种Sirtl-Nrf2新抗氧化通路在氧化损伤治疗中应用的 实验方法包括体外实验和体内试验； 如图1所示所述的体外实验包括： S101、小鼠 AEC-II的分离纯化； S102、小鼠肺泡II型上皮细胞的鉴定； S103、RT-PCR检测PQ暴露小鼠 AEC-II中Sirtl、Nrf2基因表达改变与PQ作用的 时间、剂量效应关系； S104、Western-bolt法检测PQ暴露小鼠 AEC-II中Sirtl、Nrf2蛋白表达改变与 PQ作用的时间、剂量效应关系； S105、免疫沉淀法检测PQ暴露小鼠 AEC-IINrf2的乙酰化水平； S106、化学比色法检测 SOD、CAT、GSH、MD本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种Sirt1‑Nrf2新抗氧化通路在氧化损伤治疗中应用的实验方法，其特征在于，所述的Sirt1‑Nrf2新抗氧化通路在氧化损伤治疗中应用的实验方法包括体外实验和体内试验；所述的体外实验包括：步骤一、小鼠AEC‑II的分离纯化；步骤二、小鼠肺泡II型上皮细胞的鉴定；步骤三、RT‑PCR检测PQ暴露小鼠AEC‑II中Sirt1、Nrf2基因表达改变与PQ作用的时间、剂量效应关系；步骤四、Western‑bolt法检测PQ暴露小鼠AEC‑II中Sirt1、Nrf2蛋白表达改变与PQ作用的时间、剂量效应关系；步骤五、免疫沉淀法检测PQ暴露小鼠AEC‑IINrf2的乙酰化水平；步骤六、化学比色法检测SOD、CAT、GSH、MDA；步骤七、ELISA检测HO‑1表达；步骤八、CO‑IP法检测Sirt1与Nrf2蛋白之间的相互作用；所述的体内实验包括：步骤一、小鼠原代MSC提取与培养；步骤二、BMSC的免疫荧光鉴定；步骤三、慢病毒转染BMSC细胞；步骤四、PQ中毒小鼠实验分组及模型建立；步骤五、PRC法、Western‑blot法检测Nrf2、Sirt1蛋白的表达情况；步骤六、化学比色法检测MDA、SOD、GSH、CAT改变；步骤七、ELISA法检测IL‑1β、TNF‑α、IL‑10、TGF‑β1蛋白含量；步骤八、肺组织损伤的检测。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：卢中秋，
申请(专利权)人：卢中秋，赵光举，
类型：发明
国别省市：浙江;33