本发明专利技术公开了一种Endostatin突变体、Endostatin突变体与聚乙二醇的交联物以及它们的应用。本发明专利技术要求保护将Endostatin自N末端第1位氨基酸残基和第3位氨基酸残基突变为其它氨基酸残基得到的蛋白质（命名为Endostatin突变体）；所述Endostatin是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1自N末端第2-184位氨基酸残基组成的蛋白质；（b）将（a）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与新生血管形成相关的由其衍生的蛋白质。本发明专利技术还保护所述Endostatin突变体与聚乙二醇的交联物。所述Endostatin突变体或所述交联物具有抑制和/或阻断新生血管的生成的作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种Endostatin突变体、Endostatin突变体与聚乙二醇的交联物以 及它们的应用，具体涉及它们在眼部新生血管疾病治疗中的应用。
技术介绍
视网膜和脉络膜疾病是目前眼科临床发病率越来越高且难以治疗的一类疾病， 包括早产儿视网膜病变、老年性黄斑病变、高度近视黄斑病变、增生性糖尿病视网膜病变、 视网膜静脉阻塞以及视网膜静脉周围炎所导致的视网膜脉络膜的新生血管等。据文献报 道，增生性糖尿病视网膜病变的发病率为3. 6%，70岁以上年龄组老年黄斑变性发病率可达 25%。据此预计，我国目前受到眼内新生血管性疾病困扰面临失明危险的患者人数将超过 3000万。中国每年新增DME(diabetic macular edema,糖尿病性黄斑水肿)超过30万例。 糖尿病现在是美国境内新增失明病例的主要原因，DME困扰着美国境内至少560000例糖尿 病患者，每年新增病例达75000人次。新生血管形成是这些疾病的重要表现形式，有效而安 全的抗新生血管治疗成为临床眼科医师迫切需要的治疗手段。 目前对视网膜、脉络膜新生血管（CNV)的治疗方法主要有光动力疗法、经瞳孔温 热疗法、激光光凝、放射疗法等，但这些治疗方法仅在新生血管局部起作用，临床疗效有限， 且治疗时的局部损伤又可诱发新生血管，更不能预防新生血管再形成。 诺华和罗氏联合销售的、用于治疗眼底新生血管疾病的Lucentis(兰尼单抗） 于2006年上市，2008年销售额达到17. 68亿美元，超越拉坦前列素成为全球最畅销的眼 科用药。2012年1月，Lucentis获准在中国上市，用于治疗老年相关性黄斑变性（AMD， age-related macular degeneration)。这种疾病会造成黄斑部（眼睛视网膜中心的一部 分）损伤，可能导致失明和严重的视力损失。Lucentis是一种VEGF抗体的片段，属于外源 性血管抑制剂，常见结膜出血、眼睛疼痛等副作用，极少数的出现动脉血栓、脑中风、心肌梗 死及急性冠脉综合症等严重药物不良反应事件。 1971年，美国哈佛大学儿童医学院的Judah Folkman教授提出肿瘤血管阻断理 论：肿瘤的生长和迁移依赖于新生血管生成，阻断新生血管的生成可能阻止肿瘤的生长和 转移。1996年，Judah Folkman实验室的O'Reilly发现了血管内皮抑制素（endostatin), Endostatin是在基质蛋白质中分离出来的内源性新生血管抑制因子，是胶原蛋白XVIII C 末端分子量为20kDa的片段。血管内皮抑制素可以抑制内皮细胞的迁移和增殖，进而可有 效抑制动物模型中成纤维细胞瘤（Fibrosarcoma)T241、黑色素瘤（Melanoma)B16/F10和恶 性血管内皮细胞瘤（Hemangioendothelioma) EOMA等的生长。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种Endostatin突变体、Endostatin突变体与聚乙二醇的 交联物以及它们的应用。 本专利技术要求保护将Endostatin自N末端第1位氨基酸残基和第3位氨基酸残基 突变为其它氨基酸残基得到的蛋白质（Endostatin突变体);所述Endostatin是如下（a)或 (b) : (a)由序列表中序列1自N末端第2-184位氨基酸残基组成的蛋白质；（b)将（a)经 过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与新生血管形成相关的由其衍生 的蛋白质。所述其它氨基酸残基为含羧基的氨基酸残基、含氨基的氨基酸残基、含酰胺基的 氨基酸残基或含苯环的氨基酸残基。所述Endostatin突变体具体可为如下（c)或（d): (c) 由序列表中序列3自N末端第2-184位氨基酸残基组成的蛋白质；（d)由序列表中序列5 自N末端第2-184位氨基酸残基组成的蛋白质。 本专利技术还保护含有所述Endostatin突变体的蛋白质，具体可为如下（e)或（f): (e)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（f)由序列表中序列5所示的氨基 酸序列组成的蛋白质。 本专利技术还保护所述Endostatin突变体与聚乙二醇的交联物。 本专利技术还保护含有所述Endostatin突变体的蛋白质与聚乙二醇的交联物。 所述交联物的制备方法如下：所述Endostatin突变体(或含有所述Endostatin突 变体的蛋白质）与单甲氧基聚乙二醇丙醛反应，得到交联物。 所述交联物的制备方法具体如下：取蛋白浓度为2mg/ml的所述Endostatin突变 体(或含有所述Endostatin突变体的蛋白质)的溶液，加入单甲氧基聚乙二醇丙醒并使其浓 度为l〇g/L，加入NaHBCN并使其浓度为20mM，室温放置4小时，得到含有交联物的溶液。 本专利技术还保护所述Endostatin突变体、含有所述Endostatin突变体的蛋白质、或 所述交联物在制备抑制和/或阻断新生血管的生成的药物中的应用。 本专利技术还保护一种抑制和/或阻断新生血管的生成的药物，其活性成分为所述 Endostatin突变体、含有所述Endostatin突变体的蛋白质、或所述交联物。 所述新生血管具体可为视网膜新生血管和/或脉络膜新生血管。 本专利技术还保护所述Endostatin突变体、含有所述Endostatin突变体的蛋白质、或 所述交联物在制备抑制内皮细胞迁移的药物中的应用。 本专利技术还保护一种抑制内皮细胞迁移的药物，其活性成分为所述Endostatin突 变体、含有所述Endostatin突变体的蛋白质、或所述交联物。 所述内皮细胞具体可为HMEC细胞。 以上任一所述的单甲氧基聚乙二醇丙醛的参数具体如下：分子量为2万，分散度 < L 05〇 Endostatin是一种人体本身具有的内源性血管抑制剂，其全身给药型肿瘤治疗药 物恩度已在市场上广泛应用，安全性明显优于外源性血管抑制剂药物贝阀单抗。本专利技术构 建了 Endostatin N末端Histidine突变体，试验中发现Histidine N末端突变体锌离子结 合明显下降，但其稳定性没有明显变化，且活性有提高。另外，突变后，其N末端失去了肽 酶D的作用位点，有助于提高N末端PEG或是其他物质修饰的稳定性。因 N端突变造成了 Endostatin酶切位点的改变，在突变的Endostatin N末端进行PEG修饰，其稳定性增强。 修饰产物在眼部球内注射后的半衰期为15天，可实现每月或是每2-3月给药一次，更利于 眼科球部注射的治疗。【附图说明】 图1为M-ES溶液的SDS-PAGE图谱。 图2为稳定性实验中的SDS-PAGE图谱。 图3为对肽酶D的稳定性实验中的HPLC图谱。 图4为氧诱导视网膜病变动物模型中的照片。 图5为氧诱导视网膜病变动物模型中的抑制率。 图6为脉络膜新生血管小鼠动物模型中的照片。 图7为脉络膜新生血管小鼠动物模型中的抑制率。 图8为药代曲线。【具体实施方式】 以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。 HM本文档来自技高网...
【技术保护点】
将Endostatin自N末端第1位氨基酸残基和第3位氨基酸残基突变为其它氨基酸残基得到的蛋白质；所述Endostatin是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1自N末端第2‑184位氨基酸残基组成的蛋白质；（b）将（a）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与新生血管形成相关的由其衍生的蛋白质。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黎晓新，黄旅珍，白玉婧，李臻，张娆，赵淑梅，石建国，
申请(专利权)人：北京仁和天通生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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