一种帕金森病的基因诊断试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种帕金森病的基因诊断试剂盒。该试剂盒包括11个帕金森病致病基因，包括SNCA、Parkin、Pink1、UCHL-1、DJ-1、ATP13A2、GIGYF2、HTRA2、FBX07、Vps35和MAPT，检测方法是：设计和合成各基因的特异性引物，采集待测个体的标本，运用RT-PCR技术，并将各基因得到的特异性DNA片段进行测序，然后与正常基因序列进行比对，分析是否有致病突变，以评估个体患病风险。本发明专利技术之帕金森病基因诊断试剂盒可以一次性检测致病基因蛋白编码区（CDS）不同的致病突变，方法简便快速，特异性好，灵敏度高，可用于帕金森病致病基因筛查和早期诊断。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种帕金森病的基因诊断试剂盒，属于分子生物学

技术介绍
帕金森病（Parkinson Disease, PD)是 1817 年由英国医生 James Parkinson 首次 描述，为患病频率仅次于老年痴呆症（Alzheimer's Disease)的一类神经功能障碍性疾病， 全球约1%~2%的60岁以上老人患有帕金森病（Cardo LF. ;Cote E. ;Mena L. ;et al.Mol Neurosci. 2012, 47, 425)。主要病理特征为黑质致密区多巴胺（DA)神经元变性伴胞浆内嗜 酸性包涵体即Lewy小体形成，导致黑质纹状体通路破坏及尾状核，壳核中DA含量减少。典 型临床症状表现为静止性震颤，肌肉僵直，运动迟缓和姿势反射异常，重者伴有记忆障碍和 痴呆。ro病情呈进行性加重，严重影响病人活动能力和生活质量，其生存期明显缩短，晚期 因长期卧床而死于肺炎，骨折和尿路感染等并发症。 目前ro的发病机制尚未明确，已有研宄表明与遗传、环境因素、衰老、氧化应激等 多种因素有关，是多种机制协同作用的结果。帕金森病多见于中老年人，呈隐匿缓慢性发 病。最初的症状往往不被人注意。对一个具有帕金森典型症状的患者来说，诊断是不困难 的。目前国际上采用的多是英国脑库ro诊断标准。其为运动缓慢且具有以下症状之一： 1.肌肉强直；2. 4~6Hz静止性震颤；3姿势平衡障碍（并非由原发的视觉，前庭.小脑或本 体感觉造成）.同时需排除其它帕金森症状如反复脑损伤史，进行性核上性凝视麻痹等等。 临床上多采用脑CT，MRI，SPECT，PET功能影像及辅以实验室检查如血清肾素，谷氨酸脱羧 酶（GAD)等加以排除和确诊。 但在实际生活中，个体差异使ro患者的临床表型存在极大的异质性，其症状和体 征也难以和一些疾病鉴别。如继发性震颤麻痹综合征，老年性震颤等。随着分子生物学的 发展，遗传因素在ro发病过程中越来越被关注。越来越多的ro致病基因被人们所认知，包 括 SNCA、Parkin、Pinkl、UCHL-I、DJ-I、ATP13A2、GIGYF2、HTRA2、FBX07、Vps35、MAPT 等，并 在离体和在体实验中验证了基因突变与发病密切相关。各致病基因被报道的致病突变也是 多种，如Parkin已报道突变达50多个，基因 ATP13A2突变达30多个。这些突变包括错义 突变，无义突变，缺失突变，移码突变等，分布于各外显子上。 针对帕金森病发病隐匿且异质性明显，早期的快速检测将是必要的。由于基因突 变是帕金森病发病因素之一，利用基因诊断将是有效手段。它直接检测被检者某一特定基 因的结构或者功能是否异常，相对于常规诊断，更注重个体基因状态，不仅可以对患者所患 疾病做出判断，也可以对表型正常但携带某种特定疾病基因或者特定疾病的易感性做出判 断。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，简称PCR技术）是近年发展起来体外 扩增特异DNA片段的技术，具有快速，灵敏和特异性强等特点。传统的等位基因特异性PCR 结果直观可靠，但是一次只能鉴别一个突变位点。鉴于帕金森病致病基因多，各致病基因内 可表现为不同的突变位点，且多数都发生在蛋白编码区，应用RT-PCR技术结合现在快速发 展的基因测序技术，可方便检测出帕金森病一个致病基因内所有外显子的多个突变。综合 试剂盒所列所有致病基因的突变情况，可以获得测试样本与帕金森病相关致病基因的全面 信息。本专利方法的建立为帕金森病的快速诊断和早期筛查提供技术支撑。
技术实现思路
本专利技术的目的是：提供一种帕金森病的基因诊断试剂盒，该试剂盒操作简单、准确 可靠、特异性好，可应用于患者、表型正常的携带者及产前基因诊断，从而为临床诊断和早 期的筛查提供参考。 本专利技术依据国内外对帕金森病（PD)分子遗传学研宄的成果，针对多个与帕金森 病相关的致病基因，包括 SNCA、Parkin、Pinkl、UCHL-1、DJ-1、ATP13A2、GIGYF2、HTRA2、 ?8父07、￥?835、麻?1'，发病与上述基因的蛋白编码区（〇^)基因突变密切相关。利用1^〇? 方法结合基因测序技术，以达到明确全面检测帕金森病的目的。 技术方案： 根据本专利技术的一个方面，一种帕金森病的基因诊断试剂盒，包括有用于扩增如下 基因的引物组：SNCA、Parkin、Pinkl、UCHL-l、DJ-l、ATP13A2、GIGYF2、HTRA2、FBX07、Vps35、 MAPT0 所述的引物组中的引物序列如下所示： 用于扩增SNCA基因的引物组：SEQ ID NO. 1~2 ; 用于扩增Parking基因的引物组：SEQ ID NO. 3~4 ; 用于扩增UCHL-I基因的引物组：SEQ ID NO. 5~6 ; 用于扩增Pinkl基因的引物组：SEQ ID NO. 7~10 ; 用于扩增DJ-I基因的引物组：SEQ ID NO. 11~12 ; 用于扩增ATP13A2基因的引物组：SEQ ID NO. 13~20 ; 用于扩增GIGYF2基因的引物组：SEQ ID NO. 21~26 ; 用于扩增HTRA2基因的引物组：SEQ ID NO. 27~30 ; 用于扩增FBX07基因的引物组：SEQ ID NO. 31~32 ; 用于扩增Vps35基因的引物组：SEQ ID NO. 33~34 ; 用于扩增MAPT基因的引物组：SEQ ID NO. 35~36。 根据本专利技术的另一个方面，包括有上述的引物组的帕金森病的基因诊断试剂盒。 所述的基因诊断试剂盒的反应体系中包括有：2XPCR反应缓冲液、dNTPs、引物 组、Taq 酶、CldH2O。 所述的试剂盒中还包括有RNA提取试剂和反转录试剂。 根据本专利技术的另一个方面，帕金森病的基因诊断试剂盒检测方法，包括如下步 骤： (1)样品组织RNA的提取；（2)将所得RNA反转录成cDNA ; (3) PCR反应；（4)将所 得扩增DNA片段测序；（5)测序结果与各基因的CDS进行比对，看有无致病突变。 有益效果 本专利技术的帕金森病基因诊断试剂盒及检测方法，是根据国内外对帕金森病的分子 生物学和遗传学研宄的结果，检测与帕金森病相关的一系列致病基因，包括SNCA、Parkin、 Pinkl、UCHL-l、DJ-l、ATP13A2、GIGYF2、HTRA2、FBX07、Vps35、MAPT，根据各基因保守区设计 引物，利用引物特异性扩增各基因的全部CDS区，所建立优化的的RT-PCR反应体系结合测 序技术保证了检测结果的快速性、准确性和灵敏性。使用本专利技术的基因诊断试剂盒，可以单 管一次性PCR同时检测到一个基因的CDS区内全部的致病突变位点，能够覆盖大多数患者 和携带者的诊断，并降低误诊率和有效减少个体差异引起的漏诊。该方法可运用于患者、携 带者及产前诊断，可为临床确诊疾病提供重要的依据和参考价值，也有利于对该疾病的早 期预防治疗。【附图说明】 以下图是根据本专利技术提供的试剂盒进行RT-RCR检测正常细胞株ND29194致病突 变位点电泳结果。 图1是UCHL-I基因扩增产物电泳图，泳道1是Marker，泳道2是UCHL-I ; 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种帕金森病的基因诊断试剂盒，其特征在于，包括有用于扩增如下致病基因的试剂盒：SNCA、Parkin、Pink1、UCHL‑1、DJ‑1、ATP13A2、GIGYF2、HTRA2、FBX07、Vps35、MAPT。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈实，黎寒，
申请(专利权)人：江苏雄鸣医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32