本发明专利技术公开了采用两种诱导子促进西洋参不定根中皂苷积累的方法，包括以下步骤:挑选生长良好的西洋参不定根接种到改造的3/4MS液体培养基中，培养28～30天，加入作为诱导子的水解乳蛋白水溶液母液和茉莉酸甲酯乙醇溶液母液，使水解乳蛋白终浓度为98～100mg/L，使茉莉酸甲酯终浓度为8-10mg/L，继续培养2-7天，收获，干燥。实验证明水解乳蛋白和茉莉酸甲酯两种诱导子能发挥协同作用，对西洋参不定根次级代谢产生影响，皂苷含量高，为西洋参的大规模生产提供依据，实现西洋参皂苷的工业化生产，满足人们日益增长的需求。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于作物生物
，特别是涉及一种采用两种诱导子促进西洋参不定 根中皂苷积累的方法。
技术介绍
西洋参为五加科人参属多年生草本植物，70年代在我国引种成功。其味甘、微苦， 性凉，入心、肺、肾经，具有滋补、强心、造血、健胃、镇静、降血脂、抗癌和抗衰老等多种医疗 作用，是当今社会人们一致看好的名贵强壮滋补药。 西洋参皂苷作为西洋参中的一类主要活性成分，其产量低，目前尚未人工合成。目 前，西洋参主要依赖大田培养，然而栽培的西洋参栽培技术复杂，生长周期长，"老参地"加 之生态环境破坏等问题一直难以解决，使西洋参的市场呈现供不应求的状态，为了解决这 个问题，满足人们的需要，人们尝试通过各种途径来提高西洋参次级代谢产物的含量，如组 织培养及反应器扩大培养，补料培养、两步培养、前体饲喂、毛状根的诱导、诱导子的添加 等。 目前，采用水解乳蛋白和茉莉酸甲酯这两种诱导子的协同作用在西洋参不定根培 养中尚未报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种采用两种诱导子促进西洋参不 定根中皂苷积累的方法。 本专利技术的技术方案概述如下： ，包括以下步骤：挑选生 长良好的西洋参不定根接种到改造的3/4MS液体培养基中，培养28~30天，加入作为诱 导子的水解乳蛋白水溶液母液和茉莉酸甲酯乙醇溶液母液，使水解乳蛋白终浓度为98~ 100mg/L，使茉莉酸甲酯终浓度为8~10mg/L，继续培养2~7天，收获，干燥，所述改造的 3/4MS液体培养基用下述方法制成：在3/4MS液体培养基中加入蔗糖使终浓度为30-40g/L， 加入吲哚丁酸使终浓度为3-5mg/L，加入萘乙酸使终浓度为0. 5-lmg/L，调节pH为5. 8-6. 0， 灭菌。 优选的是水解乳蛋白水溶液母液用下述方法制成：将水解乳蛋白用蒸馏水溶解配 制成浓度为lmg/ml的溶液，经0. 22 μ m滤膜过滤灭菌。 优选的是茉莉酸甲酯乙醇溶液母液用下述方法制成：将茉莉酸甲酯用无水乙醇配 制成浓度为lmg/ml的溶液，经0. 22 μ m滤膜过滤灭菌。 培养的条件优选为：无菌、23±2°C、无菌空气通气量为0. 3-0. 5vvm。 本专利技术的优点： 实验证明水解乳蛋白和茉莉酸甲酯两种诱导子能发挥协同作用，配合改造的 3/4MS液体培养基的作用，对西洋参不定根次级代谢产生影响，皂苷含量高，为西洋参的大 规模生产提供依据，实现西洋参皂苷的工业化生产，满足人们日益增长的需求。【具体实施方式】 下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明。 表1 MS培养基配方表 (1L3/4MS液体培养基的配制：取上述MS培养基配方中的3/4质量份加水至1L) 实施例1 水解乳蛋白水溶液母液的制备：将水解乳蛋白用蒸馏水溶解配制成浓度为Img/ ml的溶液，经0. 22 μ m滤膜过滤灭菌。 茉莉酸甲酯乙醇溶液母液的制备：将茉莉酸甲酯用无水乙醇配制成浓度为Img/ ml的溶液，经0. 22 μ m滤膜过滤灭菌。 实施例2 ，包括以下步骤： 挑选生长良好的西洋参不定根接种到2. 5L改造的3/4MS液体培养基中，在无菌、 23±2°C、调节通气量为0. 3vvm，自然光照条件下培养29天，加入作为诱导子的实施例1制 备的水解乳蛋白水溶液母液和茉莉酸甲酯乙醇溶液母液，使水解乳蛋白终浓度为98mg/L， 使茉莉酸甲酯终浓度为8mg/L，再以无菌、23±2°C，调节通气量为0.3vvm，自然光照条件下 培养2天，收获，干燥。 改造的3/4MS液体培养基的制备：在3/4MS液体培养基中加入蔗糖使终浓度为 35g/L，加入吲哚丁酸使终浓度为3mg/L，加入萘乙酸使终浓度为0. 5mg/L，调节pH为6,在 121 °C，0.1 MP压力下灭菌25分钟，冷却至常温，备用。 与实施例2相同的步骤，仅将水解乳蛋白和茉莉酸甲酯的终浓度分别调节为： 0mg/ml，0mg/ml (第一对照组）；98mg/ml，0mg/ml (实验 1 组）；0mg/ml，8mg/ml (实验 2 组）。 对上面的各个产物进行总皂苷含量测定与分析。 西洋参不定根培养中皂苷含量的HPLC定量分析： 实验仪器及试药： 安捷伦1200高效液相色谱仪，包括在线脱气机和四元泵。人参皂苷RgpRg2JV Rb 2、Rc、RcU Re对照品购于中国药品生物制品检定所，色谱纯甲醇，色谱纯乙腈，超纯水。 方法： 1)色谱条件 色谱柱为Kromasil C18(4. 6mmX250mm，5 μπι);流动相（A)为乙腈，流动相⑶为 超纯水；梯度洗脱程序：〇 - 35min，Α:20% ;35 - 40min，A :20% - 30% ;40 - 50min, A : 30%- 32% ;50 - 57min，A:32%- 33% ;57 - 65min，A :33%- 45%。流速 1.0 mL/min ; 进样体积为20 μ L ;柱温35°C ;检测波长203nm。 2)供试品溶液的制备 精密称取0. 2g干燥的不定根样品置于IOOmL具塞三角瓶中，加入20mL甲醇，60°C 水浴lh，趁热抽滤，重复抽提一次，合并滤液。挥干滤液，再加入IOmL蒸馏水溶解，用20mL 正丁醇萃取两次，收集正丁醇层，再经旋转蒸发处理后，甲醇定容至lmL。用0. 22 μπι微孔滤 膜过滤，得样品供试品。 3)皂苷对照品溶液的制备 精密称取经减压干燥24小时以上的西洋参皂苷Rgl、Rg2、Rb^ Rb2、Rc、RcU Re标品 各lmg，置于5mL容量瓶中，少量甲醇超声溶解，再用甲醇定容至刻度，配成0. 2mg/L的西洋 参皂苷混合标准品储备液，密封置冰箱4°C保存。检测结果见表2。 表 2 实施例3 ，包括以下步骤： 挑选生长良好的西洋参不定根接种到2. 5L改造的3/4MS液体培养基中，在无菌、 23±2°C、调节通气量为0. 4vvm，自然光照条件下培养30天，加入作为诱导子的实施例1制 备的水解乳蛋白水溶液母液和茉莉酸甲酯乙醇溶液母液，使水解乳蛋白终浓度为99mg/L， 使茉莉酸甲酯终浓度为9mg/L，再以无菌、23±2°C，调节通气量为0. 4vvm，自然光照条件下 培养5天，收获，干燥。 改造的3/4MS液体培养基的制备：在3/4MS液体培养基中加入蔗糖使终浓度为 30g/L，加入吲哚丁酸使终浓度为3mg/L，加入萘乙酸使终浓度为lmg/L，调节pH为5. 9,在 121 °C，0.1 MP压力下灭菌25分钟，冷却至常温，备用。 与实施例3相同的步骤，仅将水解乳蛋白和茉莉酸甲酯的终浓度分别调节为： Omg/ml，Omg/ml (第二对照组）；99mg/ml，Omg/ml (实验 3 组）；0mg/ml，9mg/ml (实验 4 组）。 对上面的各个产物进行总皂苷含量测定与分析，检测结果见表3。 表 3 实施例4 ，包括以下步骤： 挑选生长良好的西洋参不定根接种到2. 5L实施例1制备的改造的3/4MS液体培 养基中，在无菌、23±2°C、调节通气量为0. 5vvm，自然光照条件下培养28天，加入作为诱 导子的实施例4制备的水解乳蛋白水溶液母液和茉莉酸甲酯乙醇溶液母液，使水解乳蛋 白终浓度为l〇〇mg/L，茉莉酸甲酯的终本文档来自技高网...
【技术保护点】
采用两种诱导子促进西洋参不定根中皂苷积累的方法，其特征在于包括以下步骤:挑选生长良好的西洋参不定根接种到改造的3/4MS液体培养基中，培养28～30天，加入作为诱导子的水解乳蛋白水溶液母液和茉莉酸甲酯乙醇溶液母液，使水解乳蛋白终浓度为98～100mg/L，使茉莉酸甲酯终浓度为8～10mg/L，继续培养2～7天，收获，干燥，所述改造的3/4MS液体培养基用下述方法制成：在3/4MS液体培养基中加入蔗糖使终浓度为30‑40g/L，加入吲哚丁酸使终浓度为3‑5mg/L，加入萘乙酸使终浓度为0.5‑1mg/L，调节pH为5.8‑6.0，灭菌。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：高文远，王娟，李金鑫，李静，李建丽，刘书杰，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津;12
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