一种酮还原酶突变体及其制备和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种酮还原酶突变体及其制备和应用。一种酮还原酶突变体基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该基因编码的酮还原酶突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术通过化学、分子生物学、生物信息学及高通量筛选方法，开发的酮还原酶突变体具有较高特异性(对映体过量值>99.9%)及较好催化活性，将其与甲酸脱氢酶(FDH)及NADH共同使用，用于不对称还原2-[3-[3-(2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-氧代丙基]苯甲酸甲酯以制备(S,E)-甲基-2-[3-[3-(2-(7-氯喹啉基-2-基)乙烯基]苯基]-3-羟基丙基]苯甲酸叔丁酯。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及。
技术介绍
孟鲁司特（Montelukast),商品名顺尔宁（Singulair)，化学名为 -1-苯基]-3-丙基]硫代]甲基]环丙基乙酸钠，是由默克公司研制开发的一种高选择性半胱氨 酞白三烯（Cys-LT)受体拮抗剂，它能竞争性拮抗白三烯D4与Cys-LTl受体的结合，是治 疗阿司匹林过敏性哮喘和运动性哮喘的最优选择。孟鲁司特不仅可以改善哮喘患者的肺 功能，而且在抗炎、免疫等诸多方面也有重要的应用价值，具有广阔的应用前景。（S，E)_甲 基-2-苯基]-3-羟基丙基]苯甲酸叔丁酯(分子 式C28H24NO3Cl，分子量457. 96, CAS号142569-69-5)，是合成孟鲁司特钠(顺耳宁Singulair) 的关键中间体。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种催化活性高、对映选择性好的酮还原酶突变体基 因，及其编码的酮还原酶突变体，含有该基因的重组表达载体、基因工程菌及其制备方法， 以及该酮还原酶突变体在催化还原其他酮类底物中的应用。特别的，将该酮还原酶突变体 用于不对称还原酮类化合物的生产中。 本专利技术提供一种酮还原酶突变体基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，或者由 SEQ ID NO. 1中所示的核苷酸序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个核苷酸且具有酮 还原酶活性的由（1)衍生的基因。 本专利技术提供一种高活性的酮还原酶突变体，其是（1)由SEQ ID NO. 2所示氨基酸 序列组成的蛋白质；（2)或是由SEQ ID NO. 2中所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加 一个或者几个氨基酸且具有酮还原酶活性的由（1)衍生的蛋白质。 本专利技术的另一目的在于提供一种包含所述的的酮还原酶突变体基因的重组表达 载体。其可通过本领域常规方法将本专利技术的酮还原酶突变体基因的核苷酸序列连接于各种 载体上构建而成。所述的载体可为本领域常规的各种载体，优选PUC19。 本专利技术的另一目的在于提供一种包含本专利技术的重组酮还原酶基因或其重组表达 载体的基因工程菌，本专利技术优选大肠埃希氏菌（Escherichia coli)BL21(DE3)。将前述重 组表达质粒转化至大肠埃希氏菌（Escherichia coli)BL21(DE3)中，即可得到本专利技术优选 的基因工程菌。 本专利技术的另一目的在于提供一种利用该基因工程菌制备酮还原酶突变体的方法， 包括构建该基因工程菌；筛选得到该基因工程菌；发酵培养该基因工程菌；以及收集和制 备酮还原酶突变体。 本专利技术的另一个目的在于将由基因工程菌生产出的酮还原酶突变体应用到不对 称还原酮类化合物以制备光学活性手性醇。 根据本专利技术提供的该基因工程菌的应用，其中，底物的结构式为： 有益效果： 本专利技术通过化学、分子生物学、生物信息学及高通量筛选方法，开发了一个具有较 高特异性（对映体过量值>99. 9%)及较好催化活性的重组酮还原酶，并将其与甲酸脱氢 酶（FDH)及NADH共同使用，用于不对称还原2-苯 基]-3-氧代丙基]苯甲酸甲酯以制备（S，E)-甲基-2-苯基]-3-羟基丙基]苯甲酸叔丁酯。甲酸/甲酸脱氢酶是成功的辅酶再生体系，此 反应产生的副产物CO2对任何酶的活性均没有影响，底物甲酸价格低廉，且很多酶对甲酸有 很高的耐受性。本专利技术的反应条件温和：常温、常压、中性或接近中性PH，设备要求不高，投 入资金相对较少，且反应转化率高、对映体选择性高。【附图说明】 图1本专利技术酮还原酶突变体催化不对称还原酮类化合物以制备光学活性手性醇 的反应原理图。 生物材料保藏信息 大肠杆菌 BL21(DE3)KRED1306 (Escherichia coli BL21(DE3)KRED1306)，已于 2014年3月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏号 为 CCTCC NO :M2014078。【具体实施方式】 根据本专利技术一个实施例的重组酮还原酶基因，其来源于乳酸菌（Lactobacillus sp. Hon2N)，根据聚合酶链反应扩增（PCR)方法从乳酸菌细胞基因组中得到基因序列，通过 对其进行突变，从而获得该重组酮还原酶突变体目的基因，其基因序列为SEQ ID NO. 1。 根据本专利技术一个实施例的酮还原酶突变体突变体的蛋白序列为SEQ ID NO. 2。 根据本专利技术一个实施例的重组载体，包括本专利技术实施例的酮还原酶突变体突变体 基因，载体为PUC19,采用乳糖启动子，诱导剂为IPTG。 根据本专利技术一个实施例的生产酮还原酶多肽突变体的基因工程菌具有包括酮还 原酶多肽基因突变体的重组载体。 具体地，本专利技术的基因工程菌为保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC)的保藏 编号为CCTCC NO :M2014078的基因工程菌。 实施例1基因工程菌的建立 通过NCBI查阅酮还原酶基因（NCBI登录号为KC790015)，人工合成酮还原酶基因 片段，以该基因片段为模版，通过PCR扩增扩展该片段（片段两侧加 Hind3和EcoRl内切酶 片段）其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。并利用Hind3和EcoRl内切酶位点将基因插入 PUC19质粒中，将连接后的载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中建立酮还原酶基因工程菌。其 中PCR扩增酮还原酶基因的引物为：正向引物Fl :ATGGCTCATATTGTAATTTT(SEQ ID NO. 4)， 反向引物 F2:TTAATTCGGTTTTTTCAGTC(SEQ ID N0.5)。 实施例2酮还原酶突变体基因的获得 本研究利用易错PCR随机突变的方法，对酮还原酶进行了蛋白质工程改造。易错 PCR是在采用DNA聚合酶进行目的基因扩增时，通过调整反应条件，如提高镁离子浓度、加 入锰离子、改变体系中四种的dNTPs浓度或运用低保真度DNA聚合酶等，来改变扩增过程中 的突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，获得蛋白质分子的随机突变 体。 本研究采用较低的Taq聚合酶在特定措施下很容易向扩增产物中掺入随机突变 的原理，同时利用Mn2+替代天然辅助因子Mg2+增加易错概率。 50 μ IPCR反应体系为：10 X扩增缓冲液5 μ 1，4种dNTP混合物各100 μ mol/L，引 物各 40pmol，模板 DNA0. 5 μ g，Taq DNA 聚合酶 0· 5 μ , Mn2+2mmol/L，加双蒸水至 50 μ 1。 PCR 反应条件为：94°C预变性 5min，94°C变性 45s，50°C变性 30s，72°C变性 120s， 进行30个循环；于72°C下继续延伸lOmin，冷却至4°C。 实验流程 按照实施例1的方法PCR扩增酮还原酶基因并利用Hind3和EcoRl内切酶位点将 基因括入至PUC19质粒中，作为基因突变模板； 易错PCR扩增酮还原酶的基因，扩增后基因片段链接至PUC19-T载体，将连接后的 载体转入之大肠杆菌BL21 (DE3)中建立酮还原酶基因突变文库；利用大肠杆菌BL21 (DE3) 为宿主，PUC19质粒为载体，表达扩展酮还原酶，高通量筛选高活性突变株；突变后对高活 性酮还原酶基因进行鉴定。筛选出的高活性酮还原酶突变体基因的核本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酮还原酶突变体基因，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈峻青，石利平，尹晓龙，王清，
申请(专利权)人：江苏阿尔法药业有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32