本发明专利技术涉及分子标记领域，提供了一种利用EST‑SSR分子标记快速鉴定辣椒品种金椒纯度的方法，该方法采用专门设计的EST‑SSR引物，以金椒的叶片基因组DNA为模板进行扩增，通过对扩增结果的特异谱带对待检测金椒的品种纯度进行检测，采用这种方法可以在金椒植株生长的任何时期进行鉴定，能够将杂交种与母本自交种、父本自交种区分开来；对DNA质量要求不高且需要量少；成本较低、操作简单；重复性和稳定性较好；快速高效；准确性高，应用推广前景广阔，为开展辣椒制种和良种的及时销售提供科学依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子标记领域，具体提供了一种利用EST-SSR分子标记快速鉴定辣椒 品种金椒纯度的方法。
技术介绍
辣椒，属于茄科，是一年或多年生草本植物。辣椒以其果实特有的辣味、色泽和营 养成分已成为一种重要的世界性蔬菜。大量研宄表明辣椒果实中含有的抗氧化类物质可以 保护生物有机体免受氧化伤害和提高机体免疫力。另外，辣椒中辣椒素类物质能够加速能 量和脂类的新陈代谢及降低癌症细胞的发生率。随着大众对辣椒营养成分和药用成分的充 分认识，栽培面积逐年增加。 种子质量直接影响农产品质量和优良品种的增产潜力，开展作物种子纯度检测对 保证种子质量具有重要意义。作物品种鉴定的常用方法主要包括种子形态鉴定、田间种植 形态鉴定和同工酶电泳技术鉴定等。种子形态易受环境条件影响，鉴定结果准确性较差；田 间种植形态鉴定存在周期较长，成本较高，工作量较大，并且表型易受栽培措施和环境条件 的影响，严重影响品种鉴定的效率及准确性，越来越不能满足育种工作和生产经营的需要； 利用同工酶技术鉴定作物品种纯度虽然准确、可靠，但同工酶标记具有组织和器官特异性， 信息量非常有限，多态性不够丰富。随着辣椒新品种数量的不断增加，传统的鉴定方法难以 有效区分遗传关系较近的杂交种。 分子标记技术能够从DNA水平上揭示子代与亲本间的遗传差异，不受环境条件和 栽培措施的影响，无组织、器官及发育特异性，能够检测微小的变异，不受植株生长季节的 限制，多态性丰富、稳定性高，可以大大缩短鉴定时间。DNA分子标记技术的迅速发展，使 得从基因组水平上检测辣椒杂交种真伪和纯度成为可能。EST-SSR(expressed sequence tag-simple sequence repeat)标记，是根据EST序列中的简单串联重复序列开发的一种标 记类型，是一类由几个核苷酸为重复单位组成的串联重复序列，根据串联重复单位数目的 差异检测多态性。EST-SSR标记具有多态性丰富、共显性遗传、稳定性和重复性较好、对DNA 质量要求不高、操作简单易行、不受环境因素影响等优点，与基因组SSR标记相比，EST-SSR 标记不仅降低了开发成本、提高了开发效率，而且节省了开发时间，显著提高了其利用价 值。近年来，随着辣椒全基因组测序的完成，辣椒丰富的EST序列资源为EST-SSR标记的开 发提供了便利条件。如何利用该技术实现对辣椒品种纯度的鉴定成为亟待解决的问题之 〇
技术实现思路
本专利技术的专利技术人针对上述现有技术的情况，提供了一种利用EST-SSR分子标记 快速鉴定辣椒品种金椒纯度的方法，该方法采用专门设计的EST-SSR引物，以金椒的叶片 基因组DNA为模板进行扩增，通过对扩增结果的特异谱带对待检测金椒的品种纯度进行检 测，采用这种方法可以在金椒植株生长的任何时期进行鉴定，能够将杂交种与母本自交种、 父本自交种区分开来；对DNA质量要求不高且需要量少；成本较低、操作简单；重复性和稳 定性较好；快速高效；准确性高，应用推广前景广阔，为开展辣椒制种和良种的及时销售提 供科学依据。 本专利技术所针对的辣椒品种为金椒，金椒是山东省华盛农业股份有限公司经多年研 宄选育出的中辣丰产干、鲜两用椒。该杂交组合苗期35-50天，定植至干椒采收90-120天。 植株高90-100厘米，株幅70-80厘米左右；门椒着生节位10-13节；嫩茎和叶片上有明显的 绒毛。果实羊角形，果长12-15厘米，果肩径2. 1-2. 3厘米左右，鲜椒单果重15-21g，干椒 单果重2. 5-3. lg。嫩果绿色，成熟果深红色、自然晾干速度快、商品果率高。干椒果皮内外 红色均匀，干椒色价值高。本品种适宜全国各地辣椒主载产区，最适宜为内蒙古等嗜干椒地 区。 为了对金椒进行品种纯度的鉴定，获得母本和父本的优良杂交品种， 本专利技术的专利技术人首先提供了一对EST-SSR引物，命名为C1HS1，其正向序列为 5' -AGTTTTAAGAGCAAGGAGGCTC-3'，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；反向序列为 5' -ATCCAACCCAATCCCCAGTC-3'，其核苷酸序列如 SEQ ID No. 2 所示， 在获得上述引物之后专利技术人利用其对待测品种金椒的杂交种及其亲本的叶片基 因组DNA进行了扩增，具体过程如下： (1)提取金椒杂交种及其亲本叶片基因组DNA ; ⑵以第⑴步提取的基因组DNA为模板，用EST-SSR引物ClHSl进行PCR扩增： PCR 反应体系为 20yL，其中包括 10XPCR Buffer 2yL，0.4mM dNTPs，引物各 10 μ M，IU Taq DNA聚合酶，模板100ng，无菌超纯水补齐至20 μ L ; 扩增程序为：94°C预变性3min ;94°C变性30s，57°C退火30s，72°C延伸lmin，35个 循环；72°C终延伸IOmin ;PCR产物保存于10°C ; 专利技术人经过多次试验后发现，针对本专利技术的专利技术目的，以及专门设计的特异性引 物，扩增程序中将退火温度设置为57°C时，扩增效果最好，最终检测的结果更加贴近与实际 情况，故而将本专利技术的退火温度设定为57°C。 (3)扩增产物检测：5 μ L扩增产物与2 μ L上样缓冲液混合，之后经丙烯酰胺质量 体积比为10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，160ν恒定电压电泳I. 5h，银染显色进行带型 统计； 其中所采用的非变性聚丙烯酰胺凝胶中丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺的质量比为 29 ： 1 ； 所采用的上样缓冲液选自IOX甘油凝胶上样液； (4)根据特异谱带的扩增结果鉴定"金椒"杂交种的纯度，判定标准为： 母本具有 120bp、200bp、250bp、270bp 特异谱带；父本具有 120bp、200bp、250bp、 260bp 特异谱带；杂交种具有 120bp、200bp、250bp、270bp、400bp、450bp 特异谱带； 根据上述鉴定结果，可以换算金椒品种纯度（％) = (1-n/N) X 100%，其中N为待 测辣椒种子数目，η为单独具有父本谱带特征或单独具有母本谱带特征或既不同于"金椒" 谱带特征也不同于父母本谱带特征的植株数目。 利用上述方法，即可实现对金椒品种纯度的快速检测，能够不受栽培措施和环境 条件的影响；无器官、组织及发育特异性：该方法在植株生长的任何时期均可进行鉴定；多 态性丰富、共显性遗传：能够将杂交种与母本自交种、父本自交种区分开来；对DNA质量要 求不高且需要量少；成本较低、操作简单：该方法在苗期即可进行鉴定，节省大量人力、物 力和土地资源；重复性和稳定性较好；快速高效：7d之内即可完成种子纯度鉴定工作；准确 性高：该方法从基因组水平上揭示子代与亲本间的遗传差异，克服了田间表型鉴定带来的 误差；应用推广前景广阔：可以快速、准确检测"金椒"杂交种纯度，为开展辣椒制种和良种 的及时销售提供科学依据。【附图说明】 图1为本专利技术杂交种"金椒"种子检测特征引物的PCR电泳图谱， 其中，Pl为"金椒"母本；Fl为多组"金椒" Fl杂交种；P2为"金椒"父本；M为分 子量标准； 结果显示："金椒"Fl杂交种拥有来自父、母本的6条清晰条带，其中Fl杂交种与 父母本条带相比400bp处两条代更清晰本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用EST‑SSR分子标记快速鉴定辣椒品种金椒纯度的方法,其特征在于：利用EST‑SSR引物进行鉴定，所述的EST‑SSR引物命名为ClHS1，其正向序列为5’‑AGTTTTAAGAGCAAGGAGGCTC‑3’，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；反向序列为5’‑ATCCAACCCAATCCCCAGTC‑3’，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：袁晓伟，李兴盛，韩永升，
申请(专利权)人：山东省华盛农业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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