一种提高农杆菌介导的玉米遗传转化效率的方法技术

一种提高农杆菌介导的玉米遗传转化效率的方法，其包括：分别预热两管热激液，第一热激液预热温度为38℃，第二热激液预热为42℃，并准备冰浴条件；吸干所述离心管里的述无菌inf侵染培养基后，用所述的已经预热好的38℃无菌的第一热激液加入离心管中，并将所述离心管立即放入38℃水浴热激8分钟；随后立刻将带有所述幼胚的离心管放入冰浴中，冰浴3分钟后取出，重新加入无菌inf侵染培养基冲洗；再次吸干所述离心管里的所述无菌inf侵染培养基后，将所述的已经预热好的42℃无菌的第二热激液加入到所述离心管中，并立即放入42℃水浴热激1分30秒；第八步：将水浴温度调至20℃，使含有所述幼胚的第二热激液自然降温至20℃后，吸干离心管中的液体。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种提高农杆菌介导的玉米遗传转化效率的方法。
技术介绍
1987年，Grimsley等[25]将玉米条斑病毒的cDNA通过农杆菌介导法成功感染了玉米植株，首次证明了农杆菌可以侵染玉米；1991年Gould等[26]通过农杆菌介导玉米茎尖分生组织的遗传转化获得了阳性转基因植株；1996年Ishida等[12]用含超双元载体的根癌农杆菌侵染玉米自交系A188的幼胚，得到5％-30％的转化率，并获得可育的玉米种子，这在农杆菌介导玉米遗传转化的研究历程中具有十分重要的意义；2002年Frame等[27]用普通双元载体建立了一套稳定的农杆菌介导的玉米幼胚遗传转化系统，在同一时间，Zhao等[3]也发表了类似的文章。农杆菌介导的玉米幼胚遗传转化体系的相继建立，为农杆菌介导法的实际生产应用提供了充足的理论基础和事实依据，为农杆菌介导法的进一步发展打下了坚实的基础。在目前的提高农杆菌介导的玉米遗传转化效率的方法中，一种是在38℃热激较长的时间，另一种是在较高的42℃热激较短的时间。具体步骤如下：第一步：挑选长势相似的已经授粉9天的玉米果穗，用含有5％有效氯的次氯酸钠溶液(内含1-2滴tween 20)灭菌20min，每隔5分钟搅动一次。用无菌水冲洗2次后开始剥胚；第二步：挑选1.0-1.5mm的白色略微有点透明幼胚，装配到装有无菌inf侵染培养基的1.5mL离心管里；第三步：用无菌inf侵染培养基清洗幼胚2-3次；第四步：热激前吸干原先的inf侵染液，用已经预热好的无菌inf侵染液(含有100mM的AS)加入离心管中，并立即水浴热激；CK组常温处理，不进行热激；38度组放入38℃水浴热激9分钟；42度组42℃水浴热激3分钟；热激后立刻冰浴1分钟降低温度；第五步：用无菌inf侵染液(含有100mM的AS)重悬后的OD550＝0.3的菌液在20℃条件下侵染10min后吸干菌液盾片朝上摆到共培养培养基上；共培养3天后可使用GUS染色等方法检测侵染效率。将幼胚继续诱导成的愈伤组织，培育成为转基因植株。统计愈伤形成和获得植株数据。由后面的表2中可以看到，在38℃热激9分钟和在42℃热激3分钟均可显著提高瞬时表达效率，但却会同时大大降低愈伤组织诱导率，因此，尽管这两种方法的转化率较之室温条件下的方法具有一定提高，但是由于愈伤组织诱导率的下降，最终导致转化率提高有限。
技术实现思路
鉴于上述问题，本专利技术旨在提出一种能够显著提高转化率的提高农杆菌介导的玉米遗传转化效率的方法。本专利技术的提高农杆菌介导的玉米遗传转化效率的方法包括以下步骤：第一步：挑选长势相似的已经授粉9天的玉米果穗，用含有5％有效氯的次氯酸钠溶液灭菌20分钟，每隔5分钟搅动一次；用无菌水冲洗2次后开始剥胚；其中，所述次氯酸钠溶液含有1-2滴tween 20；第二步：挑选1.0-1.5mm的白色透明幼胚，装配到装有无菌inf侵染培养基的1.5mL离心管里；第三步：用所述无菌inf侵染培养基清洗幼胚2-3次；第四步：分别预热两管热激液，第一热激液预热温度为38℃，第二热激液预热为42℃，并准备冰浴条件；第五步：吸干所述离心管里的述无菌inf侵染培养基后，用所述的已经预热好的38℃无菌的第一热激液加入离心管中，并将所述离心管立即放入38℃水浴热激8分钟；第六步：随后立刻将带有所述幼胚的离心管放入冰浴中，冰浴3分钟后取出，重新加入无菌inf侵染培养基冲洗；第七步：再次吸干所述离心管里的所述无菌inf侵染培养基后，将所述的已经预热好的42℃无菌的第二热激液加入到所述离心管中，并立即放入42℃水浴热激1分30秒；第八步：将水浴温度调至20℃，使含有所述幼胚的第二热激液自然降温至20℃后，吸干离心管中的液体；第九步：在所述离心管中加入用无菌inf侵染培养基重悬后的OD550＝0.3的菌液，在20℃条件下侵染20分钟后吸干所述菌液，盾片朝上将所述幼胚摆到共培养培养基上，共培养3天。优选地，所述第一热激液包含1g/L的NH4Cl、0.34g/L的MgSO4、150mg/L的KCl、10mg/L的CaCL2、3mg/L的FeSO4、0.5mol/L的NaH2PO4、20g/L的蔗糖、19.52g/L的MES、200μmol/L的AS、100mg/L的SM；所述第二热激液包含1/2N6salts、N6维生素、2.0mg/L的2,4-D、0.115g/L的脯氨酸、68.4g/L的蔗糖、36g/L的葡萄糖、0.5g/L的MES、0.1g/L的肌醇、100mM的AS。优选地，所述无菌inf侵染培养基为pH 5.2，且包含：1/2N6salts、N6维生素、2.0mg/L的2,4-D、0.7g/L的脯氨酸、68.4g/L的蔗糖、36g/L的葡萄糖、0.5g/L的MES、0.1g/L的肌醇、100mM的AS。优选地，所述共培养培养基pH为5.8，其包含：1/2N6salts、N6维生素、2.0mg/L的2,4-D、0.7g/L的脯氨酸、30g/L的蔗糖、0.5g/L的MES、0.1g/L的肌醇、0.154g/L的DDT、0.3g/L的半胱氨酸、0.85mg/L的硝酸银、100μM的AS、8g/L的琼脂。本专利技术的提高农杆菌介导的玉米遗传转化效率的方法通过多次热激和降温，使得细胞每次需要承受的高温不是很长，但总体时间却足够长，所以，本专利技术的方法对愈伤组织的活性影响不大，同时保证了热激提高农杆菌的转化效率。本专利技术的方法通过一定时间的热激后冷却来使植物细胞更容易进入感受态的状态，使得植物细胞更容易接受外源的DNA。本专利技术首次提出了四段式的热激法，首创了温差预处理法，利用两种不同热激温度和两次降温的温差，大幅提高了遗传转化效率。说明书附图图1为pCAMBIA3301-EPSPS中T-DNA区段示意图。具体实施方式下面，详细说明本专利技术的提高农杆菌介导的玉米遗传转化效率的方法。1植物材料以1.0-1.5mm的白色略微有点透明Hi-Ⅱ玉米幼胚为受体材料。2农杆菌及质粒以根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404为侵染菌株，由中国农业大学提供；pCAMBIA3301-EPSPS为侵染质粒，由李敬娜[71]构建，试验室保存。其中pCAMBIA3301为常用载体，EPSPS为抗草甘膦筛选标记。pCAMBIA3301、EPSPS为公开本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高农杆菌介导的玉米遗传转化效率的方法，其包括以下步骤：第一步：挑选长势相似的已经授粉9天的玉米果穗，用含有5％有效氯的次氯酸钠溶液灭菌20分钟，每隔5分钟搅动一次；用无菌水冲洗2次后开始剥胚；其中，所述次氯酸钠溶液含有1‑2滴tween 20；第二步：挑选1.0‑1.5mm的白色透明幼胚，装配到装有无菌inf侵染培养基的1.5mL离心管里；第三步：用所述无菌inf侵染培养基清洗幼胚2‑3次；第四步：分别预热两管热激液，第一热激液预热温度为38℃，第二热激液预热为42℃，并准备冰浴条件；第五步：吸干所述离心管里的述无菌inf侵染培养基后，用所述的已经预热好的38℃无菌的第一热激液加入离心管中，并将所述离心管立即放入38℃水浴热激8分钟；第六步：随后立刻将带有所述幼胚的离心管放入冰浴中，冰浴3分钟后取出，重新加入无菌inf侵染培养基冲洗；第七步：再次吸干所述离心管里的所述无菌inf侵染培养基后，将所述的已经预热好的42℃无菌的第二热激液加入到所述离心管中，并立即放入42℃水浴热激1分30秒；第八步：将水浴温度调至20℃，使含有所述幼胚的第二热激液自然降温至20℃后，吸干离心管中的液体；第九步：在所述离心管中加入用无菌inf侵染培养基重悬后的OD550＝0.3的菌液，在20℃条件下侵染20分钟后吸干所述菌液，盾片朝上将所述幼胚摆到共培养培养基上，共培养3天。...

【技术特征摘要】
1.一种提高农杆菌介导的玉米遗传转化效率的方法，其包括以下步骤：
第一步：挑选长势相似的已经授粉9天的玉米果穗，用含有5％有效氯的
次氯酸钠溶液灭菌20分钟，每隔5分钟搅动一次；用无菌水冲洗2次后开始剥
胚；其中，所述次氯酸钠溶液含有1-2滴tween 20；
第二步：挑选1.0-1.5mm的白色透明幼胚，装配到装有无菌inf侵染培养基
的1.5mL离心管里；
第三步：用所述无菌inf侵染培养基清洗幼胚2-3次；
第四步：分别预热两管热激液，第一热激液预热温度为38℃，第二热激液
预热为42℃，并准备冰浴条件；
第五步：吸干所述离心管里的述无菌inf侵染培养基后，用所述的已经预
热好的38℃无菌的第一热激液加入离心管中，并将所述离心管立即放入38℃水
浴热激8分钟；
第六步：随后立刻将带有所述幼胚的离心管放入冰浴中，冰浴3分钟后取
出，重新加入无菌inf侵染培养基冲洗；
第七步：再次吸干所述离心管里的所述无菌inf侵染培养基后，将所述的
已经预热好的42℃无菌的第二热激液加入到所述离心管中，并立即放入42℃水
浴热激1分30秒；
第八步：将水浴温度调至20℃，使含有所述幼胚的第二热激液自然降温至
20℃后，吸干离心管中的液体；
第九步：在所述离心管中加入用无菌inf侵染培养基重悬后的OD550＝0.3
的菌液，在20℃条件下侵染20分钟后吸干所述菌液，盾片朝上将所述幼胚摆
到共培养培养基上，共培养3天。
2.如权利要求1所述的提高农杆菌介导的玉米遗传转化效率的...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘亚，任雯，赵久然，徐游，李婷，周秒依，陈浩，杨凤玲，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：北京;11