从干细胞中生成血红细胞和血小板制造技术

本发明专利技术提供了制备巨核细胞-红系祖细胞(MEP)的方法，包括在芳基烃受体(AhR)调节剂存在的情况下在培养基中将MEP前体细胞分化为MEP。在一些实施方法中，该AhR调节剂是AhR拮抗剂。在一些实施方法中，该AhR调节剂是AhR激动剂。在一些实施方式中，这些方法包括在AHR拮抗剂存在的情况下培养MEP前体细胞，然后在AHR激动剂存在的情况下培养MEP前体细胞。在一些实施方式中，该干细胞是多潜能干细胞。在一些实施方式中，该MEP共表达CD41和CD235。在一些实施方式中，培养物中生产的MEP数目呈指数增加。还提供了制备血红细胞(RBC)的方法，包括在AhR调节剂存在的情况下培养MEP。还提供了制备巨核细胞和/或血小板的方法，包括在AhR调节剂存在的情况下培养MEP。在一些实施方法中，该AhR调节剂是AhR拮抗剂。本发明专利技术还提供了其中每毫升包含至少100万MEP的组合物以及其中至少50％的细胞是MEP的组合物等。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉参考本申请要求2012年8月15日提交的美国临时申请号61/683,246和2013年3月14日提交的美国申请号13/828,357的优先权，这两份申请的内容都通过引用纳入本文。政府基金本专利技术是在政府支持下由国家卫生研究院(National Institutes of Health)授予的合同号HL107443、ES11624和ES007381资助完成。政府对本专利技术享有某些权利。引言输血是一种必需的细胞治疗，且血液供应的安全性和充足性受到国家和国际关注。仅在2009年，国家血液数据资源中心(National Blood Data Resource Center)报道血库机构收集了超过1700万单位的全血和红细胞，其中美国的医院每年为超过1500万的患者进行输血。由于血型抗原的丰富多态性，即使在发达国家中也长期缺乏供于一些患者组的血液。在美国，超过40％的镰状细胞贫血患者(其大部分是非洲血统)在输入来自供者(其大部分是高加索血统)的血液时经历免疫反应。偶发性血液供应短缺也会以与天灾或人祸相关联的方式出现。越来越受到关注的还有：血液供应可能因供者资格的新限制而削减，这是因为新的血液传播疾病被发现和/或出现并传播至新的地理位置。最后，数量日益增多的60岁以上个体的用血量预计将增加，这将导致2050年出现血液供应不足。针对这些和其他原因，本领域中需要用于制备血红细胞和血小板的新方法。还需要用于制备髓系-红系祖细胞(MEP)的新方法，其例如能够产生血红细胞和/或血小板。
技术实现思路
专利技术人获得了新的观察结果，其涉及芳基烃受体(AhR)信号转导在血红细胞(RBC)和血小板以及作为RBC和血小板前体的细胞类型的分化过程中的作用。发明人已应用其发现以使本专利技术涉及如下领域：制备巨核细胞-红系祖细胞(MEP)的方法、制备RBC的方法、制备巨核细胞(Mk)的方法和制备血小板的方法。发明人还已应用其发现以使本专利技术涉及以下领域：RBC、Mk、血小板、MEP、MEP前体细胞和包含这些细胞类型中至少一种的组合物。本专利技术还提供了向对象提供RBC、Mk和血小板中至少一种的方法以及根据对RBC、Mk和血小板中至少一种的作用筛选化合物的方法。还提供了通过给予AhR调节剂来增加RBC计数和增加血小板计数的方法。下文更完整地描述了本专利技术的这些和其他方面。本专利技术提供了制备巨核细胞-红系祖细胞(MEP)的新方法。在一些实施方式中，这些方法包括在芳基烃受体(AhR)调节剂存在的情况下在培养物中将MEP前体细胞分化为MEP。在一些实施方式中，该MEP前体细胞是多潜能干细胞(pluripotent stem cell)。在一些实施方式中，这些方法包括在AHR拮抗剂存在的情况下培养MEP前体细胞。在一些实施方式中，这些方法包括在AHR激动剂存在的情况下培养MEP前体细胞。在一些实施方式中，这些方法包括在AHR拮抗剂存在的情况下培养MEP前体细胞，然后在AHR激动剂存在的情况下培养MEP前体细胞。在这些方法的一些实施方式中，培养物不包含血清。在这些方法的一些实施方式中，培养物不包含饲养细胞。在一些实施方式中，这些方法包括在选自BMP-4、vVEGF、WNT3a、bFGF、hSCF、FLT3、TPO和EPO中至少一种的蛋白质存在的情况下在培养物中将多潜能干细胞分化为MEP。在一些实施方式中，这些方法包括在BMP-4、vVEGF、WNT3a、bFGF、hSCF、FLT3、TPO和EPO存在的情况下在培养物中将多潜能干细胞分化为MEP。在一些实施方式中，这些方法还包括在芳基烃受体(AhR)调节剂存在的情况下培养MEP前体细胞。在一些实施方式中，这些方法还包括在芳基烃受体(AhR)拮抗剂存在的情况下培养MEP前体细胞。在一些实施方式中，这些方法还包括在芳基烃受体(AhR)激动剂存在的情况下培养MEP前体细胞。在一些实施方式中，这些方法还包括在AHR拮抗剂存在的情况下培养MEP前体细胞，然后在AHR激动剂存在的情况下培养MEP前体细胞。在一些实施方式中，这些方法包括a)在补充有BMP-4、VEGF、Wnt3a和无血清替代品(KOSR)的RPMI培养基中培养多潜能干细胞；b)在补充有BMP-4、VEGF、Wnt3a和KOSR的RPMI培养基中培养获自步骤a)的细胞；c)在补充有BMP-4、VEGF和bFGF的StemPro 34培养基中培养获自步骤b)的细胞；d)在补充有VEGF和bFGF的StemPro 34培养基中培养获自步骤c)的细胞；e)在补充有B27、N2-补充物、BSA、VEGF、bFGF、hSCF和Flt3配体的IMDM和Hams F12的混合物中培养获自步骤d)的细胞；以及f)在补充有B27、N2-补充物、BSA、VEGF、bFGF、hSCF、Flt3配体、hTPO、IL-6和EPO的IMDM与Hams F12的混合物中培养获自步骤e)的细胞。在一些实施方式中，培养步骤a)至e)中至少一步的培养基中还包含AhR拮抗剂。在一些实施方式中，培养步骤f)的培养基中还包含AhR激动剂。在这些方法的一些实施方式中，多潜能干细胞选自胚胎干细胞(ES)、诱导性多潜能干细胞(iPSC)和细胞核移植生成的细胞。在一些实施方式中，iPCS细胞表达OCT4、KLF4、SOX2和cMYC。在一些实施方式中，MEP共表达CD41和CD235。在一些实施方式中，MEP不表达CD34。在一些实施方式中，培养物在10天内开始形成MEP细胞。在一些实施方式中，培养物在7天内开始形成MEP细胞。在一些实施方式中，培养物持续生成新的MEP细胞至少30天。在一些实施方式中，培养物中生成的MEP数目呈指数或基本呈指数增加，其中“基本呈指数”指在相对时期内有至少97％的理论“指数生长”。在一些实施方式中，培养物中生成的MEP数目在1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、15小时、18小时、24小时、48小时、72小时或96小时的培养期间内呈指数增加。在一些实施方式中，培养物每毫升包含至少100万MEP。在一些实施方式中，培养物每毫升包含至少1000万MEP。在一些实施方式中，培养物中至少10％的细胞是MEP。在一些实施方式中，培养物中至少50％的细胞是MEP。在一些实施方式中，培养物生成至少1000万MEP。在一些实施方式中，培养物生成至少1亿MEP。还提供了通过本专利技术的方法制备的MEP。还提供了包含通过本本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备巨核细胞‑红系祖细胞(MEP)的方法，所述方法包括在芳基烃受体(AhR)调节剂存在的情况下在培养物中将MEP前体细胞分化为MEP。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.08.15 US 61/683,246;2013.03.14 US 13/828,3571.一种制备巨核细胞-红系祖细胞(MEP)的方法，所述方法包括在芳基烃受
体(AhR)调节剂存在的情况下在培养物中将MEP前体细胞分化为MEP。
2.如权利要求1所述的方法，所述方法包括在AHR拮抗剂存在的情况下培养
MEP前体细胞。
3.如权利要求1所述的方法，所述方法包括在AHR激动剂存在的情况下培养
MEP前体细胞。
4.如权利要求1所述的方法，所述方法包括在AHR拮抗剂存在的情况下培养
MEP前体细胞，然后在AHR激动剂存在的情况下培养MEP前体细胞。
5.如权利要求1所述的方法，所述MEP前体细胞是多潜能干细胞。
6.如权利要求1所述的方法，所述培养物不包含血清。
7.如权利要求1所述的方法，所述培养物不包含饲养细胞。
8.一种制备MEP的方法，所述方法包括在BMP-4、vVEGF、WNT3a、bFGF、
hSCF、FLT3、TPO和EPO存在的情况下在培养物中将多潜能干细胞分化为MEP。
9.如权利要求8所述的方法，所述方法还包括在AHR拮抗剂存在的情况下培
养MEP前体细胞。
10.如权利要求8所述的方法，所述方法还包括在AHR激动剂存在的情况
下培养MEP前体细胞。
11.如权利要求8所述的方法，所述方法还包括在AHR拮抗剂存在的情况
下培养MEP前体细胞，然后在AHR激动剂存在的情况下培养MEP前体细胞。
12.如权利要求8所述的方法，所述方法包括：
a)在补充有BMP-4、VEGF、Wnt3a和无血清替代品(KOSR)的RPMI培养
基中培养所述多潜能干细胞；
b)在补充有BMP-4、VEGF、bFGF和KOSR的RPMI培养基中培养步骤a)
中获得的细胞；
c)在补充有BMP-4、VEGF和bFGF的StemPro 34培养基中培养步骤b)中获
得的细胞；
d)在补充有VEGF和bFGF的StemPro 34培养基中培养步骤c)中获得的细胞；
e)在补充有B27、N2-补充剂、BSA、VEGF、bFGF、hSCF和Flt3配体的
IMDM和Hams F12混合物中培养步骤d)中获得的细胞；以及
f)在补充有B27、N2-补充剂、BSA、VEGF、bFGF、hSCF、Flt3配体和
hTPO、IL-6和阿法依泊汀的IMDM和Hams F12混合物中培养步骤e)中获得的细
胞。
13.如权利要求12所述的方法，其中，培养步骤a)至e)中至少一步中的培
养基中还包含AhR拮抗剂。
14.如权利要求12所述的方法，其中，步骤f)中的培养基还包含AhR激动
剂。
15.如权利要求8所述的方法，所述多潜能干细胞选自胚胎干(ES)细胞、
诱导性多潜能干细胞(iPSC)和细胞核移植生成的细胞。
16.如权利要求15所述的方法，所述iPSC细胞表达OCT4、KLF4、SOX2
和cMYC。
17.如权利要求1所述的方法，所述MEP共表达CD41和CD235。
18.如权利要求1所述的方法，所述MEP不表达CD34。
19.如权利要求1所述的方法，所述培养物在10天内开始生成MEP细胞。
20.如权利要求19所述的方法，所述培养物在7天内开始生成MEP细胞。
21.如权利要求1所述的方法，所述培养基继续生成新的MEP细胞至少30
天。
22.如权利要求1所述的方法，所述培养物中生成的MEP数目在24小时的
培养期间内呈指数增长。
23.如权利要求1所述的方法，所述培养物每毫升包含至少100万MEP。
24.如权利要求1所述的方法，所述培养物每毫升包含至少1000万MEP。
25.如权利要求1所述的方法，所述培养物中至少10％的细胞是MEP。
26.如权利要求1所述的方法，所述培养物中至少50％的细胞是MEP。
27.如权利要求1所述的方法，所述培养物生成至少1000万MEP。
28.如权利要求1所述的方法，所述培养物生成至少1亿MEP。
29.一种MEP，其通过权利要求1所述的方法制备。
30.一种细胞培养物，其包含通过权利要求1所述方法制备的MEP。
31.一种制备血红细胞(RBC)的方法，所述方法包括：
根据权利要求1所述的方法制备MEP，以及
在足以制造RBC的条件下培养所述MEP。
32.如权利要求31所述的方法，所述足以制造RBC的条件包括在AhR激
动剂存在的情况下培养所述MEP。
33.如权利要求31所述的方法，所述足以制造RBC的条件包括在红系细胞
特化培养基中培养。
34.如权利要求33所述的方法，所述足以制造RBC的条件还包括在AhR
激动剂存在的情况下培养。
35.一种制备血红细胞(RBC)的方法，所述方法包括：
提供权利要求29所述的MEP，以及
在足以制造RBC的条件下培养所述MEP。
36.如权利要求35所述的方法，所述足以制造RBC的条件包括在AhR激
动剂存在的情况下培养所述MEP。
37.如权利要求35所述的方法，所述足以制造RBC的条件包括在红系细胞
特化培养基中培养。
38.如权利要求37所述的方法，所述足以制造RBC的条件还包括在AhR
激动剂存在的情况下培养。
39.一种制备血红细胞(RBC)的方法，所述方法包括在AhR激动剂存在的
情况下培养MEP。
40.如权利要求39所述的方法，所述方法还包括在红系细胞特化培养基中
培养所述MEP。
41.如权利要求39所述的方法，所述培养物每毫升包含至少100万RBC。
42.如权利要求39所述的方法，所述培养物每毫升包含至少1000万RBC。
43.如权利要求39所述的方法，所述培养物中至少10％的细胞是RBC。
44.如权利要求39所述的方法，所述培养物中至少50％的细胞是RBC。
45.如权利要求39所述的方法，所述培养物生成至少1000万RBC。
46.如权利要求39所述的方法，所述培养物生成至少1亿RBC。
47.一种通过权利要求39所述方法制备的RBC。
48.一种输注组合物，其包含权利要求47所述的RBC。
49.一种培养物，其包含通过权利要求39所述方法制备的RBC。
50.一种制备巨核细胞(Mk)的方法，所述方法包括：
根据权利要求1所述的方法制备MEP，以及
在足以制造Mk的条件下培养所述MEP。
51.如权利要求50所述的方法，所述足以制造Mk的条件包括在AhR调节
剂存在的情况下培养所述MEP。
52.如权利要求51所述的方法，所述AhR调节剂是AhR拮抗剂。
53.如权利要求50所述的方法，所述方法包括在AhR激动剂存在的情况下
培养所述MEP，然后在AhR拮抗剂存在的情况下培养。
54.如权利要求50所述的方法，所述足以制造Mk的条件包括在巨核细胞
特化培养基中培养。
55.如权利要求54所述的方法，所述足以制造Mk的条件还包括在AhR调
节剂存在的情况下培养。
56.如权利要求55所述的方法，所述AhR调节剂是AhR拮抗剂。
57.如权利要求54所述的方法，所述足以制造Mk的条件还包括在AhR激
动剂存在的情况下培养所述MEP，然后在AhR拮抗剂存在的情况下培养。
58.一种制备Mk的方法，所述方法包括：
提供权利要求29所述的MEP，以及
在足以制造Mk的条件下培养所述MEP。
59.如权利要求58所述的方法，所述足以制造Mk的条件包括在AhR调节
剂存在的情况下培养所述MEP。
60.如权利要求59所述的方法，所述AhR调节剂是AhR拮抗剂。
61.如权利要求58所述的方法，所述方法包括在AhR激动剂存在的情况下
培养所述MEP，然后在AhR拮抗剂存在的情况下培养。
62.如权利要求58所述的方法，所述足以制造Mk的条件包括在巨核细胞
特化培养基中培养。
63.如权利要求62所述的方法，所述足以制造Mk的条件还包括在AhR调
节剂存在的情况下培养。
64.如权利要求63所述的方法，所述AhR调节剂是AhR拮抗剂。
65.如权利要求62所述的方法，所述足以制造Mk的条件还包括在AhR激
动剂存在的情况下培养所述MEP，然后在AhR拮抗剂存在的情况下培养。
66.一种制备Mk的方法，所述方法包括在AhR调节剂存在的情况下培养
MEP。
67.如权利要求66所述的方法，所述方法还包括在巨核细胞特化培养基中
培养所述MEP。
68.如权利要求66所述的方法，所述AhR调节剂是AhR拮抗剂。
69.如权利要求68所述的方法，所述方法还包括在巨核细胞特化培养基中
培养所述MEP。
70.如权利要求66所述的方法，所述方法包括在AhR激动剂存在的情况下
培养所述MEP，然后在AhR拮抗剂存在的情况下培养。
71.如权利要求70所述的方法，所述方法还包括在巨核细胞特化培养基中

【专利技术属性】
技术研发人员：G·J·墨菲，D·H·谢尔，S·S·罗泽尔，B·W·史密斯，
申请(专利权)人：波士顿医疗中心股份有限公司，波士顿大学托管会，
类型：发明
国别省市：美国;US