一种检测水体类金属砷的微生物学方法技术

本发明专利技术涉及一种检测水体中类金属砷的微生物学方法，具体涉及利用基因工程改造的大肠埃希氏菌报告菌株构建方法，及建立其在检测水体中砷的方法。本发明专利技术所述检测菌株的构建，首先采用Red重组系统敲除野生型大肠杆菌MC4100砷抗性的arsB基因，然后采用基因敲入技术将pars-arsR-gfpmut2报告基因置换到araB编码基因位置后获得。本发明专利技术所述生物检测菌株名称为E.coli WMC-011p，对砷的最低检测范围符合《污水综合排放标准》---GB8978-1996。本发明专利技术所述菌株克服了基于质粒载体的生物检测菌株具有的荧光本底值高、检测信号不稳定、结果不精确等缺点，具有特异性强、灵敏度高和成本低等特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测水体中类金属砷的微生物学方法，具体涉及利用基因工程改造的大肠埃希氏菌报告菌株的构建方法，及建立其在检测水体环境中类金属砷的方法。
技术介绍
砷，是广泛分布于自然界的非金属元素。地壳中的含量约为2～5mg/kg，为构成地壳元素的20位。类金属砷是被国际癌症研究署(IARC)归类为一级的人类致癌物。世界不同地区的21个国家受到了砷污染的影响，最大的风险群体来自孟加拉国，其次是印度的西孟加拉国，中国也是砷危害最重的国家之一。水体类金属砷污染已经在我国局部地区表现为公害病(如广东英德市横石塘镇龙新村岭下村组发生集体砷中毒事件、四川省凉山州西昌市安宁镇饮用水井砷污染事件、贵州省独山县瑞丰矿业公司违法排污造成砷污染事件、湖南省怀化市辰溪县一家硫酸厂违法排污造成村民砷中毒事件、广西河池市砷污染事件、河南省大沙河两起砷污染事件、苏鲁交界邳苍分洪道两起砷污染重大突发环境事件等)。因此，引起了人们的高度重视。在土壤、水、矿物、植物中都能检测出微量的砷。在正常人体组织中也含有微量的砷。随着科学技术的迅速发展，大量含砷化工厂建立，砷及其化合物被广泛应用于冶金以及各种除草剂、农药、化肥、杀菌剂的使用，在水体和土壤中的含量逐年增加，继而在一些植物或动物体内积累(如砷污染区的大米、贝壳类海鲜、动物肝肾脏等)，并通过食物链在人体内蓄积，为目前已知的最易在体内蓄积的毒物之一。砷对人体毒性很大，对肾、肺、肝、生殖、脑、皮肤、呼吸、肠道及血液系统均可产生毒性，砷在体内的生化功能还未确定，但研究提示砷可能在某些酶反应中起作用，以砷酸盐替代磷酸盐作为酶的激活剂，以亚砷酸盐的形式与巯基反应作为酶抑制剂，从而可明显影响某些酶的活性。有人观察到，在做血透析的患者其血砷含量减少，并可能与患者中枢神经系统紊乱、血管疾病有关。砷对环境的污染，主要是由工业废水排放引起(我国规定工业废水中砷的最高排放浓度为0.1mg·L-1)。因此，对环境水体中类金属砷的检测显得尤为必要。目前监测和检测金属污染物主要有两种方法：(1)物理化学分析法，如电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)、电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)气体氢化原子吸收光潜法(gaseous hydride atomic absorption spectrometry，HGAAS)等，在文献Belkin S.Microbial whole-cell sensing systems of environmental pollutants.Current Opinion in Microbiology 2003Jun；6(3)：206-12中。其优点是具备高检测灵敏度和高特异性，但也存在一些不足，如仪器设备昂贵，操作复杂，检测周期长，最重要的一点是，传统的物理化学方法主要是对环境重金属 总量进行测定，不能检测重金属的生物可利用度；而化学显色法、电化学法等，灵敏度、选择性不高，不易准确定量，特别是针对水体中生物有效性(bioavailability)重金属的检测，可选的特异、敏感、快速和便携的检测方法更少，难以对水体中重金属生物毒性效应进行客观评价。(2)基于生物有机体的微生物法，其一般分为基于质粒和基于基因组整合型两种。质粒整合型具有成本低、特异性强、快速、易操作等优点，但是基于质粒载体的生物检测菌株存在细菌传代后质粒拷贝数不均一(数量过高或丢失)而导致检测信号不稳定、荧光本底值高和独立实验重复性不好等缺陷。利用模式生物大肠埃希氏菌(Escherichia coli，E.coli)对特定化学物质分子反应的生物检测技术克服了如上不足，因此，建立一种特异、敏感、快速、廉价、稳定及精确的生物检测技术及其产品来评价环境中砷的生物毒性大小已经成为当务之急。在一系列新的检测方法中，生物监测方法，特别是利用微生物全细胞传感器来检测污染物已成为国际环境科学研究的热点之一。生物检测技术的基本原理即是利用模式生物对特定化学物质的分子反应机理。对于生物检测技术而言需要三种必需的元件：针对特定或具有相似性质的化学物质的感应器；由感应器控制的启动子；受此启动子控制的报告基因。在设计生物检测技术时，由于细菌具有在环境中大量存在、生长快速、低成本及易维护等优点而受到研究人员普遍亲睐。在过去的研究中利用生物检测法来检测环境中的特定污染物已经引起了极大的关注，至今已经研发了一系列针对特定有机物和无机化合物的生物检测菌株及其产品，如：重金属、甲苯及其衍生物等。目前对砷在大肠埃希氏菌的具体耐受机制已有大量研究，对砷离子测定的生物检测技术也有所研发，大肠埃希氏菌具有精细的调控系统使得细胞内砷离子保持在较低的水平，有研究已发现大肠埃希氏菌中有两种负责编码将砷离子泵出基因，一种是存在于质粒上的arsA基因和arsB基因共同作用形成膜离子通道蛋白将砷泵出来维持细胞体内平衡，另一种是存在于基因组上的不含arsA基因而只含arsB基因形成膜离子通道蛋白将砷泵出来维持细胞体内平衡。查阅文献，研究人员尝试在DH5a大肠埃希氏菌基础上构建检测砷离子的模式生物。但砷是一种常见的剧毒性环境污染类金属，大部分细菌对砷具有耐受性以及抗性，故其敏感性不高。且这些研究是基于质粒作为表达载体，然而基于质粒载体的生物检测元件存在本底值高，细菌传代后质粒拷贝数不均一(数量过高或丢失)，导致检测信号不稳定等缺陷。其作为检测砷的宿主菌会造成检测的不稳定和最低检测限偏高，这些非常不利于污染物的检测，必须采用新的方法提高生物学检测方法检测砷离子的敏感性，以有效解决当前环境监测工作中遇到的瓶颈问题。Judith Stocker在Development of a Set of Simple Bacterial Biosensors for Quantitative and Rapid Measurements of Arsenite and Arsenate in Potable Water Environ sci Technol.2003Oct 15；37(20)：4743-50.中等构建的基于质粒上的大肠埃希氏菌生物传感器，其构 建策略是将大肠埃希氏菌质粒上arsR启动子arsR基因与luxCDABE基因或荧光蛋白基因或萤火虫荧光素酶基因进行基因融合，再连接到pET28b质粒载体上。其能被砷诱导发光，且是在野生大肠埃希氏菌基础上构建检测砷离子的模式生物，存在荧光不稳定性、本低值高等缺陷。在专利《一种检测砷生物可利用度的微生物细胞传感器》CN 102796693 A中，大肠埃希氏菌E.coli作为宿主细胞承载重组质粒。重组质粒为含有砷抗性系统ars启动子、砷抗性系统调控基因arsR、荧光素酶基因luc和rrnb终止子串联序列的pUC18质粒。同样是基于质粒的微生物传感器，存在上述基于质粒作为表达载体的多种缺陷。重金属微生物检测技术的应用受到限制而发展缓慢。
技术实现思路
本专利技术的目的：1.采用基因工程技术构建一株荧光本底值低、灵敏度高、特异性强、稳定、快速和成本低及定量检测水体中类金属砷浓度的大肠埃希氏菌生物检测菌株；2.建立一种检测水体中类金属砷的微生物学方法。专利技术内本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株大肠埃希氏菌WMC‑011p的应用，其特征在于所述大肠埃希氏菌(Escherichia coli)WMC‑011p CGMCC No.9760应用于水体类金属砷的检测。

【技术特征摘要】
1.一株大肠埃希氏菌WMC-011p的应用，其特征在于所述大肠埃希氏菌(Escherichia coli)
WMC-011p CGMCC No.9760应用于水体类金属砷的检测。
2.根据权利要求1所述的一株大肠埃希氏菌WMC-011p的应用，其特征在于大肠埃希氏菌
WMC-011p构建方法，包含以下步骤：
(1)采用Red重组系统敲除赋予野生型大肠埃希氏菌MC4100砷抗性的arsB基因；
(2)设计araB基因N末端和C末端的内侧引物和外侧引物以及pars-arsR-gfpmut
2基因的引物，采用交叉PCR技术构建含有报告基因pars-arsR-gfpmut2与araB基因的两端
同源臂的融合PCR片段；
(3)将步骤(2)所得片段克隆到pMD18-T载体上，构建pars-arsR：：gfpmut2-T重组载体；
(4)测序分析正确的重组载体pars-arsR：：gfpmut2-T经双酶切切下目的条带连接到pKOV载
体上，构建融合报告载体pKOV-ars-arsR：：gfipmut2；
(5)将所述重组载体pKOV-ars-arsR：：gfpmut2转入到步骤(1)所得的大肠埃希氏菌菌株中，
通过两次同源重组，将ars-arsR：：gfpmut2报告基因置换到步骤(1)所得的大肠埃希氏菌ΔarsB
菌株基因组中的araB编码基因位置。
3.根据权利要求1所述的一株大肠埃希氏菌WMC-011p的应用，其特征在于大肠埃希氏菌
WMC-011p菌株检测水体中类金属砷的标准化流程为：
(1)取5-10μl E.coli WMC-011p冻存菌液接于5ml LB培养基中，37℃，250rpm，过夜培
养；
(2)取步骤(1)中1％体积过夜菌种子液加入到含有终浓度为...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕建新，纪松军，周怀彬，杜璟，郑美琴，
申请(专利权)人：温州医科大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33