高效纤维素分解酶制剂及其生产方法技术

提供一种组合物，所述组合物包括在纤维素生物质上生长的产生多纤维素酶体的微生物的未经处理的细胞颗粒。进一步提供组合物的生产方法及其在纤维素底物水解中的用途。特别地，所述组合物有利地包含或者细胞自身表达的或者外部添加至细胞颗粒的细胞外β-葡糖苷酶。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于纤维素生物质(cellulosic biomass)降解的酶制剂。本专利技术还涉及所述酶制剂的生产方法和利用其降解纤维素底物的方法。
技术介绍
植物细胞壁组分，主要为纤维素和半纤维素，提供优质的碳源和能源。由植物材料生产乙醇例如要求三个连续步骤：生理化学预处理、纤维素和半纤维素水解为可溶性糖，以及发酵为乙醇。最具挑战、耗时且昂贵的工序是水解步骤，并且为降低处理成本以及使其有效且具有成本效益而作出了很大的努力。木质素纤维素，为纤维素、木质素和任选的半纤维素的基质，也由于纤维素与半纤维素和周围的木质素高度结合产生高度有序、结构紧凑的晶体结构而难以水解。仅几种微生物已经获得将这些结构降解为可溶性糖的能力。例如，厌氧嗜热性细菌热纤梭菌(Clostridium thermocellum)显示出一种最高效降解体系，称为“多纤维素酶体”(cellulosome)。多纤维素酶体被认为是紧密靠近细菌细胞使酶活性协同的多酶体系。多纤维素酶体为当在纤维素物质上生长时在纤维素分解细菌的细胞壁上产生的突起。这些突起是牢固结合至细菌细胞壁但也足够柔韧地紧密结合至微晶纤维素的稳定的酶复合物。多纤维素酶体由多种水解活性组成。其中有催化水解纤维素链内的内部键(internal bonds)并随机产生新链末端的内切葡聚糖酶；和在暴露末端裂解纤维素链从而主要产生纤维二糖的外切葡聚糖酶。其它酶包括木聚糖酶、碳水化合物酯酶、胶质裂合酶等。通常以两种主要方法来使用多纤维素酶体蛋白质复合物。第一种方法为活的生长中的细菌的酶-微生物组装体的一部分(参见，例如，Lu等人，2006，Enzyme-microbe synergy during cellulose hydrolysis by Clostridium thermocellum.Proc Natl Acad Sci U S A 103:16165-9)。在该方法中，细菌典型地以其最佳生长条件生长于木质素纤维素物质上，并且将由与细胞联结且分离的纤维素酶所产生的可溶性糖用于酵母发酵或通过细菌直接转化成乙醇。第二种方法涉及提取和分离在生长稳定期期间于细菌培养基中剪切的多纤维素酶体复合物。然后将分离的多纤维素酶体复合物用于降解纤维素物质。这两种方法在例如，生物质载量、细菌:生物质之比和对抑制剂的高敏感性方面有诸多局限性。对多纤维素酶体的研究主要针对无细胞多纤维素酶体组分而进行。关于用天然底物产生的细胞-结合的多纤维素酶体的潜在活性所知甚少，这是由于迄今为止公开的工作仅限于在纤维二糖或微晶纤维素(Avicel)上的细胞生长(Zhang等人，2003.Quantification of cell and cellulase mass concentrations during anaerobic cellulose fermentation:development of an enzyme-linked immunosorbent assay-based method with application to Clostridium thermocellum batch cultures.Anal Chem 75:219-27)。完全未公开或暗示能够收集在纤维素生物质上生长的产生多纤维素酶体的微生物的颗粒，并且在没有处理或纯化酶或细胞组分的情况下，用于在工业规模上降解纤维素。仍存在对于生物质、特别是异常纤维素生物质降解改进的需求。例如，具有简单经济地生产同时显示出高溶纤活性的纤维素降解组合物将非常有益。
技术实现思路
本专利技术提供含有产生多纤维素酶体的微生物的颗粒、其生产方法和使用其降解纤维素底物的方法。本专利技术首次公开了能够收集在纤维素生物质上生长的产生多纤维素酶体的微生物的粗颗粒制剂，并且在没有进一步处理的情况下用于有效地降解纤维素底物。本专利技术部分基于下列发现：在产生多纤维素酶体的细菌在纤维素生物质的存在下生长之后收集的颗粒级分显示出显著的溶纤活性。与迄今记载的利用无细胞多纤维素酶体和多纤维素酶体组分水解纤维素物质的方法相比，所述颗粒作为粗制剂使用，而无需分离酶或者分离出在颗粒级分内包含的细胞和其它物质如未水解的生物质残余。出乎意料地，如下文所示，发现粗颗粒的活性优于已知的商购酶混合液(enzyme cocktails)的活性。有利地，根据本专利技术的原理使包含在颗粒内的产生多纤维素酶体的微生物的细胞失活，由此允许比活细胞纤维素水解更广的纤维素水解条件。另外，由于微生物是非生命的，因而水解期间不发生可溶性糖的同化，并且可获得更高的可溶性糖浓度。本专利技术的组合物进一步包括β-葡糖苷酶。如下文所例举的，出乎意料地发现根据本专利技术的实施方案将β-葡糖苷酶添加至未处理的颗粒制剂显著改进制剂的活性并导致增强的纤维素降解。根据一个方面，本专利技术提供一种纤维素分解酶组合物，所述纤维素分解酶组合物包括产生多纤维素酶体的微生物的未处理颗粒，其中包含在颗粒内的产生多纤维素酶体的微生物的细胞被失活；且进一步包括可检测的胞外β-葡糖苷酶。在某些实施方案中，颗粒的特征在于，蛋白质:纤维素物质之比在约6:1-1:10(w/w)的范围内，例如约3:1-1:5(w/w)，和DNA:纤维素物质之比在约1:800-1:50(w/w)的范围内，例如约1:400-1:25(w/w)。如本文所使用的，“颗粒”是指培养后培养基的不溶性组分。术语“上清液”包括培养后培养基的可溶性组分。有利地，根据本专利技术的实施方案，微生物在纤维素物质上生长。培养后，上清液典型地包含游离的酶、从细胞脱离的多纤维素酶体、纤维素物质降解期间释放的用于使微生物生长的可溶性糖、以及营养素等。颗粒通常包括产生多纤维素酶体的微生物的失活细胞、细胞结合的多纤维素酶体复合物、和结合有纤维素分解酶的残留的未水解或部分水解的纤维素物质。本专利技术的组合物包括颗粒组分并实质上没有上清液的组分。如本文所使用的，“实质上没有上清液的组分”表明组合物包含小于10％、优选小于5％、小于3％、小于1％、小于0.5％(w/w)的残留的上清液的组分。本专利技术组合物中的微生物细胞是失活的。如本文所使用的，“失活”表示已死亡细胞或濒死细胞。典型地，至少80％的细胞失活，例如至少85％的细胞失活，至少90％的细胞失活，至少95％的细胞失活，或100％的细胞失活。每种可能性代表本专利技术独立的实施方案。颗粒的蛋白质:纤维素物质之本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纤维素分解酶组合物，其包括产生多纤维素酶体的微生物的未经处理的颗粒，其中包含在所述颗粒中的所述产生多纤维素酶体的微生物的细胞失活；并且所述纤维素分解酶组合物进一步包括可检测的细胞外β‑葡糖苷酶。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.01.10 US 61/750,8271.一种纤维素分解酶组合物，其包括产生多纤维素酶体的微生物的未经
处理的颗粒，其中包含在所述颗粒中的所述产生多纤维素酶体的微生物的细
胞失活；并且所述纤维素分解酶组合物进一步包括可检测的细胞外β-葡糖苷
酶。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述颗粒的特征在于，蛋白质:
纤维素物质之比在约6:1-1:10(w/w)的范围内，和DNA:纤维素物质之比在
1:800-1:50(w/w)的范围内。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述颗粒为湿颗粒。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述颗粒为干颗粒。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述产生多纤维素酶体的微生物
为厌氧的。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述产生多纤维素酶体的微生物
为需氧的。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述产生多纤维素酶体的微生物
为嗜热的。
8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述产生多纤维素酶体的微生物
为嗜温的。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述产生多纤维素酶体的微生物
为细菌。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述细菌为厌氧嗜热性细菌。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述厌氧嗜热性细菌选自由热
纤梭菌、清黄梭菌和约氏梭菌组成的组。
12.根据权利要求9所述的组合物，其中所述细菌为厌氧嗜温性细菌。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述厌氧嗜热性细菌选自由解
纤梭菌、嗜纤维梭菌、解纤维醋弧菌、溶纤维素拟杆菌和瘤胃球菌属物种组

\t成的组。
14.根据权利要求1所述的组合物，其中所述产生多纤维素酶体的微生物
为真菌。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述真菌为厌氧、嗜温性真菌。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述厌氧、嗜温性真菌选自由
新美鞭菌属物种、梨囊鞭菌属物种和根囊鞭菌属物种组成的组。
17.根据权利要求1所述的组合物，其中所述β-葡糖苷酶通过所述产生多
纤维素酶体的微生物重组产生。
18.根据权利要求1所述的组合物，其中所述β-葡糖苷酶被外源添加至所
述组合物。
19.根据权利要求18所述的组...

【专利技术属性】
技术研发人员：伊利·莫拉格，塔勒·巴拉克，阿龙·卡尔波利，迈克尔·安巴尔，
申请(专利权)人：设计师能源有限公司，
类型：发明
国别省市：以色列;IL