一种建立人胚胎干细胞向嗜酸性粒细胞分化模型的方法技术

一种建立人胚胎干细胞向成熟嗜酸性粒细胞定向分化模型的方法，包括：hESCs H1细胞株维持未分化培养；mAGM-S3基质细胞的准备；H1细胞株与mAGM-S3共培养产生造血干/祖细胞；造血干/祖细胞的液体悬浮培养；共培养及悬浮培养得到的细胞进行流式细胞学表面分子检测；选取无基质细胞培养条件下的H1细胞株未分化集落与经13.3GrayX射线照射的小鼠基质细胞AGM-S3共培养，获得多能造血干/祖细胞，悬浮培养，定向诱导分化为成熟嗜酸性粒细胞。之后进行计数、甩片、May-Giemsa染色观察细胞形态、免疫荧光染色观察Eos细胞内颗粒蛋白的表达、流式细胞学检测细胞表面分子的表达和进行功能实验。利用本方法能显著提高嗜酸性粒细胞体外诱导分化的效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及再生医学领域，特别涉及一种建立人胚胎干细胞向嗜酸性粒细胞分化 模型的方法。
技术介绍
嗜酸性粒细胞（Eosinophils，Eos)是一种颗粒性白细胞，起源于骨髓造血干细 胞，在骨髓内分化成熟后进入外周血。虽然Eos仅占外周血白细胞的0. 4% -8 %，但却是极 重要的炎症介质细胞，在介导过敏反应、寄生虫感染和调节免疫系统中具有重要功能，是多 种临床疾病的重要研宄点和突破口。因此，建立一种高效的嗜酸性粒细胞体外定向诱导分 化模型可为研宄其分化和成熟机理以及相关疾病的病理和治疗研宄奠定基础。 但目前无论是对嗜酸性粒细胞发育分化的研宄还是对其特异性疾病治疗的探宄 都很少。虽然早期有部分研宄将人类脐带血造血干细胞、外周血和骨髓的⑶34+细胞诱导 出嗜酸性粒细胞，但由于嗜酸性粒细胞纯度不高，缺乏特异性表型分子的鉴定等，始终停留 在方法学阶段。此外，前期研宄的细胞来源于人体内，细胞资源有限，限制了临床的大规模 石开宄和应用 ° J. Owen 等（Differentiation in vitro of hybrid eosinophil/basophil granulocytes:autocrine function of an eosinophil developmental intermediate. J Experimental Med, 1995, 182(1) :49-57.)曾在体外用 Matrigel 覆盖的培养皿，添加适 量的rhIL-3和rhIL-5成功将脐带血造血祖细胞培养出含有嗜酸性和嗜碱性粒细胞特征 的前体细胞，再进一步的悬浮培养可得到嗜酸性粒细胞。H. Saito等（Gene expression accompanied by differentiation of cord blood-derived CD34+cells to eosinophils. International Archives of Allergy and Immunol, 2001，125 (suppl 1):2-6.)将脐带血 ⑶34+的细胞用SCF、IL-3、IL-5和GM-SCF培养3周获得嗜酸性粒细胞。以上研宄均是从 脐带血和外周血着手，研宄的都是成体造血的范围，尚无从hESCs特异性定向分化诱导嗜 酸性粒细胞来研宄胚胎造血的相关工作报道。况且这些研宄得到的嗜酸性粒细胞纯度不是 很高，而且由于缺乏特异性表型分子的鉴定，无法确定嗜酸性粒细胞的发育途径。 近几年有研宄发现Siglec-8是成熟嗜酸性粒细胞唯一特异性的表面抗原，能 作为特异性的标记分子对成熟嗜酸性粒细胞进行筛选和鉴定（Floyd H, Ni J, Cornish AL, et al. Siglec_8A novel eosinophil-specific member of the immunoglobulin superfamily· J Biolog Chem, 2000, 275(2) :861-866.)。0)88是主要表达在嗜酸性粒细胞、 嗜碱性粒细胞和肥大细胞表面的表面的特定谱系分子。CD34是胚胎造血干细胞特异性标 志，⑶45是髓系细胞特异性标志，⑶43是髓系细胞发育标志，⑶14主要分布在单核细胞、巨 噬细胞和树突细胞的细胞表面，c-Kit主要表达在肥大细胞表面，Fc ε Rl主要表达在肥大 和嗜碱性粒细胞表面。2D7主要在嗜碱性粒细胞表达。EPO是成熟嗜酸性粒细胞胞内特异 性表达的颗粒蛋白，可作为功能特定分子用于鉴定成熟嗜酸性粒细胞。LPS(脂多糖）作为 革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分，能够被天然免疫细胞表面重要模式识别受体之一 TLR4 所识别，通过招募接头蛋白分子MyD88 (或TRIF)，激活下游的NF- κ B等信号通路，产生一系 列的促炎因子或干扰素，从而启动天然免疫防御机制，保护宿主细胞免受病原微生物的侵 入。因此，本实验采用LPS刺激试验来验证本体系得到的细胞是否具有免疫功能。综合以 上表面分子标志和特异性颗粒蛋白以及功能实验来确证本体系从hESCs定向诱导分化出 的细胞是否是成熟嗜酸性粒细胞。 人类胚胎干细胞具有无限增殖和多向分化的潜能，是体外研宄的理想种子细胞， 能克服细胞来源有限的缺点。体外诱导人类胚胎干细胞向嗜酸性粒细胞的分化，能更好模 拟体内嗜酸性粒细胞的发育途径，揭示嗜酸性粒细胞的早期发育过程和相关的分子调控机 制。我们的研宄有望利用hESCs培养出的大量高纯度的成熟嗜酸性粒细胞作为分子药物筛 选的模型而应用于新药的开发并为组织再生医学工程和转化医学治疗提供良好的模型。
技术实现思路
为解决上述现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种建立人胚胎干细胞 向成熟嗜酸性粒细胞高效定向诱导分化模型的方法。且利用本方法能显著提高嗜酸性粒细 胞体外诱导分化的效率。 为达到上述目的，本专利技术的技术方案为： -种建立人胚胎干细胞向嗜酸性粒细胞分化模型的方法，将未分化的hESCs (Hl) 细胞与经13. 3Gray X射线辐照处理后的mAGM-S3细胞共培养一段时间后，加入造血诱导分 化液经一定条件培养得到造血干/祖细胞，将造血干/祖细胞扩增后，利用细胞因子培养液 使造血干/祖细胞进入嗜酸性粒细胞诱导分化阶段，持续培养后更换细胞因子培养液使嗜 酸性粒细胞趋于成熟，之后检测确定成熟嗜酸性粒细胞纯度和功能。 进一步的，，包括如下步 骤： 步骤一 ：hESCs维持未分化培养 hESCs (Hl)维持未分化培养采用无基质细胞培养方法，将未分化hESCs克隆接种 于包被有基质蛋白matrigel的培养皿上，用商品化的mTeSRl培养基进行培养，每天去除 分化细胞，更换培养基，培养条件为37°C，5% CO2。每隔5- 7天用浓度为0. 5mM的EDTA在 37°C，5% CO2条件下消化3 - 4min，以1:4一 1:6的比例传代细胞； 步骤二：mAGM-S3基质细胞的准备 接种mAGM-S3细胞株于明胶包被的6孔板中，培养基为α-ΜΕΜ、5%胎牛血清， 每天更换培养基，培养条件为37°C，5% CO2。待mAGM-S3细胞融合度不低于90%时，采用 13. 3Gray X射线辐照处理后再换新鲜mAGM-S3细胞培养基备用，得到约2 X IO5细胞/孔； 步骤三：hESCs与mAGM-S3共培养产生造血干/祖细胞 在显微镜下用200 μ L枪头枪尖将hESCs未分化集落划分成数个小集落，每个集落 约0. 5-1 X IO3细胞，以50-70个集落/6孔板每孔，接种集落于准备好的mAGM-S3细胞上， 加 hESCs未分化细胞维持液2-3mL，轻柔摇勾，37°C，5 % CO2培养3天，得到约2 X 10 5hESCs/ 孔，用造血诱导分化液再培养14天，产生大量造血干/祖细胞，收集细胞备用；培养过程中 每天换液；第6天以后根据细胞培养情况可一天换液2次； 步骤四：液体悬浮培养 液体悬浮培养分为三个阶段进行，第一阶段主要是刺激造血干/祖细胞扩增，第 二阶段主要是诱导嗜酸性粒细胞分化，第三阶段主要是诱导嗜酸性粒细胞成熟，三个阶段 分别各7天，共21天； 1)将步骤三中共培养14天的细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种建立人胚胎干细胞向嗜酸性粒细胞定向分化模型的方法，其特征在于，将培养未分化的hESCs与经13.3Gray X射线辐照处理后的mAGM‑S3细胞共培养3天后，加入造血诱导分化液经一定条件培养得到造血干/祖细胞，将造血干/祖细胞扩增后，利用细胞因子培养液使造血干/祖细胞进入嗜酸性粒细胞诱导分化阶段，持续培养后更换细胞因子培养液使嗜酸性粒细胞趋于成熟，之后检测确定成熟嗜酸性粒细胞纯度和功能。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：马峰，
申请(专利权)人：中国医学科学院输血研究所，
类型：发明
国别省市：四川;51