基于RCA的局部扩增方法技术

本发明专利技术提供了用于进行包括至少两轮RCA的局部RCA反应的方法，其中将第二RCA反应的产物附着并从而局限于第一RCA反应的产物，所述方法包括：(a)提供第一RCA产物；(b)将包含或提供用于第二RCA反应的引物的探针与所述第一RCA产物直接或间接杂交；和(c)使用(b)的所述RCA引物进行第二RCA反应以形成第二RCA产物，其中在所述反应中：(i)所述探针和所述引物不能引发使用所述第一RCA产物作为模板的延伸，或限制任何所述延伸以避免与所述第一RCA产物杂交的任何探针的置换；(ii)维持(b)的所述RCA引物与所述第一RCA产物的直接或间接杂交并且，依靠所述杂交，所述第二RCA产物附着于所述第一RCA产物；(iii)用于所述第二RCA反应的RCA模板包含在所述探针中或由所述探针提供，或被单独提供。所述方法在分析物的检测中是特别有用的，其中所述分析物为核酸或其中核酸用作或产生为所述分析物的标志物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基于RCA的局部扩增方法
本专利技术总体上属于利用滚环扩增(RCA)的核酸扩增领域，具体属于在至少两轮扩增中产生基于RCA的局部高度线性扩增的构思。第二(或进一轮)RCA反应的产物并非以物理方式源自第一(或更早的)RCA产物，并且第二轮或进一轮的RCA扩增提供了用于放大可从滚环扩增反应获得的信号的方式。本专利技术的方法包括通过第二单独的RCA模板的RCA产生第二RCA产物。通过确保第二RCA的反应产物物理附着于第一RCA反应的产物，可获得局部扩增反应。本专利技术提供了此类方法，并且在来自基于检测RCA产物的检测测定的信号的放大中特别有用。
技术介绍
滚环复制(RCR)是实质上用于环状DNA分子诸如质粒或病毒的复制的机制。该反应已被采用作为用于扩增环状分子的实验室方法的基础，并且已被证实可用于多种使用或产生环状核酸分子作为报告分子的测定中，其中通过RCA扩增(复制)环状分子，并且检测复制或扩增的环状核酸分子。在其他方法中，可通过RCA来环化并扩增所需分子或靶分子。因此，滚环复制(RCR)现在通常被称为滚环扩增(RCA)，并且这些术语在本文中可互换使用。RCA涉及使用环状单链核酸分子例如寡核苷酸作为滚环模板，并使用链置换聚合酶延伸与所述环状模板杂交的引物(所述链置换活性置换引物并有效地使环“滚动”)进行的核酸分子的合成。引物在某些典型测定中可由靶核酸(RNA或DNA)分子提供。聚合酶和核苷酸的添加启动合成反应，即聚合。由于滚环模板是无尽的，因此所得产物是由与滚环模板互补的串联重复组成的长单链核酸分子(即多联体)。实际上，RCA反应通常利用线性核酸分子，例如寡核苷酸诸如在下文中更详细描述的锁式探针，通常通过例如使用连接酶将所述核酸分子的末端连接在一起来操纵所述核酸分子以产生环状核酸模板分子。例如，可通过与用作连接模板的靶核酸分子上的相邻序列杂交来将核酸分子的末端彼此接近。环状核酸分子的形成使得其在RCA反应中能够被拷贝。该反应可通过向封闭环添加引物来引发，或可从靶核酸分子即连接模板产生引物。初始引物从而形成RCA产物的部分。这可以是特别有利的，因为其可允许对靶核酸进行局部检测，即在其中固定用于引发RCA的核酸分子的实施方案中，所述RCA产物也将被固定。因此，RCA产物可保留作为核酸环的一串串联重复互补拷贝(多联体)，其对于原位检测是特别有用的，但也可在均相(“溶液中”)测定中被检测到。例如，RCA反应可在仅1小时内导致环的1000倍扩增(基于由约100个核苷酸组成的环)。因此，环状寡核苷酸的RCA可产生形成直径可为约1μm的DNA束或“串滴(blob)”的RCA产物。所述产物可通过缀合于荧光标记的核酸探针的杂交来检测，即串滴DNA，所述杂交允许通过荧光显微镜术或流式细胞术使串滴可视化。在其它实施方案中，可通过用限制性内切酶或核酶进行消化来将RCA产物还原成单体，随后检测所述单体。由于RCA反应产生可容易检测的信号的能力，因此其用作用于检测样品中的任何核酸分子的报告系统，所述核酸分子可以是靶核酸分子(即靶待检测的核酸分子，或其中所述核酸分子是测定的"分析物")，或其可以是待检测作为靶分析物存在的标志物(或替代物)的核酸分子。因此，RCA反应已被用于直接检测细胞和组织样品中的靶核酸，例如核酸分子的原位(即局部)检测，这对于研究和诊断目的具有重大意义。然而，RCA测定不限于用于非均相形式，而且还可用于均相测定(参见例如WO2009/037659)。RCA也已被用于用于检测其它分析物，即除核酸分子外的分析物诸如蛋白质、肽等的方法。在这方面，已开发了多种测定法，其中核酸分子可用于直接或间接标识或标记样品中的靶分析物，并且所述核酸分子的检测用于指示分析物在样品中的存在。在一些方法中，当一种或多种分子与靶分析物相互作用(例如，结合)时，可在样品中产生新的核酸分子(即不存在于原始样品中并且不是添加至样品的组分之一的核酸分子)。所产生的核酸分子的检测指示样品中的所述分析物。基于使用RCA反应作为检测策略的部分来检测此类替代物或标志核酸分子的各种方法在本领域中进行了详尽描述，包括例如免疫-RCA、使用锁式探针的测定和产生环状核酸分子的接近式探针的测定。在所有这些情况下，所述方法依赖于提供或产生随后可用作RCA反应的底物(模板)的环状核酸分子，并且RCA产物随后可被检测作为用于直接检测靶分析物的替代物。免疫-RCA包括利用核酸分子标记特定靶分析物的抗体。通常，靶分析物例如被第一抗体被捕获在底物上，并与抗体:核酸复合物接触。将环状(或可环化的)寡核苷酸与缀合于所述抗体的核酸杂交(可预先杂交所述寡核苷酸，或在已使抗体与靶分析物相互作用后添加所述寡核苷酸)。可在将样品经历RCA以扩增环状/环化的寡核苷酸之前洗掉过量的抗体。缀合于抗体的核酸分子用作进行RCA的引物。因此，RCA产物被系连于与靶分析物相互作用的抗体，从而允许局部检测样品中，例如细胞或组织样品中的分析物。接近式测定依赖于"接近探测"的原理，其中通过多个(即2个或更多个，通常2个或3个)探针的结合来检测分析物，所述探针，当通过结合于分析物而被拉近(从而称为“接近式探针”)时，允许信号产生。通常，接近式探针的至少一个包含连接于探针的分析物结合域的核酸域，并且信号的产生牵涉核酸部分和/或由其它探针携带的其它功能性部分之间的相互作用。因此信号的产生取决于探针之间的相互作用(更具体地讲是通过核酸或由它们携带的其它功能性部分/域进行)，并因而仅当探针已结合于分析物时才发生，从而赋予检测系统提高的特异性。近年来接近探测的构思已得到发展，许多基于该原理的测定现在本领域中是公知的。例如，接近式连接测定(PLA)依赖于接近式探针与分析物的靠近结合，以从牵涉接近式探针的核酸域的或由所述核酸域(例如在其之间和/或以其为模板)介导的连接反应产生信号。接近式探针的核酸域在接近时，基于所谓的锁式探针原理(如例如由Landegren等人在WO99/49079中描述的)，可作为一个或多个添加的寡核苷酸的彼此连接(包括分子内连接)的模板来环化一个或多个添加的线性寡核苷酸，从而形成核酸环。在此类方法中，通过与由一个或多个接近式探针的核酸域提供的一个或多个环化模板杂交使添加的线性寡核苷酸的末端并置以便连接。各种此类测定式描述于WO01/61037中。因此明显的是，RCA可在样品中任何核酸分子的特异性检测中具有效用，无论其为样品中的“原始”靶分析物，还是其为通过特定检测分子例如接近式探针与靶分析物例如蛋白质的相互作用产生的“替代”靶分析物。RCA还可用于检测扩增的核酸分子。例如，在其中靶核酸分子以低量存在的样品(例如稀有转录物)中，RCA可用于通过增加可用于被检测的核酸的量来“增强”检测。基本RCA反应的各种改进已被提出，包括提供高度线性扩增，例如以提高基于检测RCA产物的测定的灵敏度。这些方法中的许多方法还包括扩增在第一RCA反应中产生的信号，即基于第一RCA产物的扩增。一般地这些方法集中在使用第一RCA反应的产物作为引物延伸的模板的技术上。例如，在超分支RCA反应(HBRCA)中，引物与通过第一RCA反应产生的多联体RCA产物中的每一个串联重复杂交。随后使用第一RCA产物作为模板延伸引物。随着每一个引物被本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于进行包括至少两轮RCA的局部RCA反应的方法，其中第二RCA反应的产物附着并从而局限于第一RCA反应的产物，所述方法包括：(a)提供第一RCA产物；(b)将包含或提供用于第二RCA反应的引物的探针与所述第一RCA产物直接或间接杂交，和(c)使用(b)的所述RCA引物进行第二RCA反应以形成第二RCA产物，其中在所述反应中：(i)所述探针和所述引物不能引发使用所述第一RCA产物作为模板的延伸，或限制任何所述延伸以避免与所述第一RCA产物杂交的任何探针的置换；(ii)维持(b)的所述RCA引物与所述第一RCA产物的直接或间接杂交并且，依靠所述杂交，所述第二RCA产物附着于所述第一RCA产物；(iii)用于所述第二RCA反应的RCA模板包含在所述探针中或由所述探针提供，或被单独提供。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.11.14 GB 1220503.5;2013.05.23 GB 1309327.31.一种用于进行包括至少两轮RCA的局部RCA反应的方法，其中第二RCA反应的产物附着并从而局限于第一RCA反应的产物，所述方法包括：(a)提供第一RCA产物；(b)将探针与所述第一RCA产物直接或间接杂交，其中所述探针包含或提供用于第二RCA反应的引物，和(c)使用(b)的所述RCA引物进行第二RCA反应以形成第二RCA产物，其中在所述反应中：(i)所述探针和所述引物不能引发使用所述第一RCA产物作为模板的延伸，或限制任何所述延伸以避免与所述第一RCA产物杂交的任何探针的置换，其中：(A)如果所述探针包含或释放不与所述第一RCA产物杂交的游离3’末端，所述探针在所述探针或引物的3’末端和所述杂交的区之间包含一个或多个经修饰的区，所述经修饰的区用于抑制3'核酸外切酶降解返回至与所述第一RCA产物杂交的所述探针的区，(B)如果所述探针包含与所述第一RCA产物杂交的3’末端并且所述3’末端不是连接所需的，所述探针在所述3’末端上或其附近包含修饰，所述修饰用于抑制从探针3'末端的延伸，或(C)如果所述探针包含与所述第一RCA产物杂交并且是连接所需的3’末端，所述探针在杂交的可连接的5’末端上或其附近被修饰，以包含置换阻断区，以抑制所述探针与所述第一RCA产物的链置换，和/或使用与所述第一RCA产物杂交的阻断性寡核苷酸，以防止可能从探针的3'末端发生的任何延伸延伸进入和置换任何下游探针，以避免与所述第一RCA产物杂交的任何探针的置换；(ii)维持(b)的所述RCA引物与所述第一RCA产物的直接或间接杂交并且，依靠所述杂交，所述第二RCA产物附着于所述第一RCA产物；(iii)用于所述第二RCA反应的RCA模板包含在所述探针中或由所述探针提供，或被单独提供。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述探针与存在于所述第一RCA产物的单体中的探针结合位点杂交或与中间核酸分子杂交，所述中间核酸分子与存在于所述第一RCA产物的单体中的互补序列杂交。3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中步骤(a)包括产生第一RCA产物。4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)、(b)和(c)同时进行。5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)、(b)和(c)相继地进行。6.根据权利要求1所述的方法，其中重复步骤(a)、(b)和(c)一次或多次。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述探针包含：(i)至少一个结合域，其包含与靶核酸分子互补的区，所述靶核酸分子为第一RCA产物；(ii)引物域，其包含或能够提供用于所述第二RCA反应的引物；和(iii)至少一个RCA-模板互补域，其包含与用于所述第二RCA反应的环状或可环化模板互补的区；和任选的(iv)至少一个连接-模板域，其包含或能够提供用于环化用于所述第二RCA的可环化模板的连接模板；和/或(v)至少一个RCA模板域，其包含或能够提供用于所述第二RCA反应的环状或可环化模板；其中所述域是分开的或重叠的。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述探针包含一条或多条组成型核酸链，和任选地一个或多个双链区，其可通过分子内杂交或通过单独核酸链的分子间杂交形成。9.根据权利要求7所述的方法，其中所述探针为线性寡核苷酸或包含所述线性寡核苷酸，并且其中2个结合域被提供在所述寡核苷酸的3'和5'末端的每一个上，并且所述探针经杂交以使所述末端并置以便彼此直接或间接地连接，所述方法还包括将所述探针末端彼此直接或间接地连接。10.根据权利要求1所述的方法，其中除非所述探针已与所述第一RCA产物直接或间接杂交，否则所述引物不能引发所述第二RCA反应。11.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一RCA产物被固定在固体载体上；并且所述方法包括在进行步骤(c)的所述第二RCA反应之前洗除任何未结合的探针的附加步骤。12.根据权利要求1所述的方法，其中所述探针被切割和/或解折叠以释放所述RCA引物。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述切割和/或解折叠取决于所述探针与所述第一RCA产物的直接或间接杂交，或其中用于所述第二RCA反应的引物/RCA模板复合物只有在所述探针已与所述第一RCA产物直接或间接杂交时才能形成。14.根据权利要求12所述的方法，其中(i)所述探针包含在所述杂交时被解折叠以释放能够用作用于第二RCA反应的引物的引物域的发夹结构；或(ii)在所述探针与所述第一RCA产物杂交时，产生切割识别位点，并且所述探针被切割以释放能够用作用于第二RCA反应的引物的引物；或(iii)所述探针包含切割识别位点，并且所述探针被切割以释放能够用作用于第二RCA反应的引物的引物。15.根据权利要求1所述的方法，其中单独地提供环状或可环化的第二RCA模板...

【专利技术属性】
技术研发人员：乌尔夫·兰德格伦，陈磊，吴迪，农园，卡罗林·加朗，
申请(专利权)人：欧凌科公司，
类型：发明
国别省市：瑞典;SE