新重组因子C、其制造方法、及内毒素的测定法技术

本发明专利技术提供一种制造鲎的重组因子C的方法。将CHO DG44及HEK293等哺乳类细胞用作宿主细胞而表达鲎的因子C，从而制造鲎的重组因子C。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及新重组因子C、其制造方法、及内毒素的测定法。
技术介绍
内毒素是存在于革兰氏阴性细菌的细胞壁外膜上的脂多糖，且己知是强致热原。 此外，己知的是，即使少量的内毒素也会造成归因于细菌感染的不同疾病状态，诸如由巨噬 细胞活化引起的炎症性细胞因子的释放和内毒素性休克的诱导以及发热。因此，以注射用 药为代表的药物、水、医疗设备等中的内毒素的检测是重要的。此外，内毒素被认为是革兰 氏阴性细菌感染中的休克的主要原因，因此，通过测量血液中的内毒素，可以判定感染的有 无及治疗效果。 此外，己知的是，若革兰氏阴性细菌感染美洲豐（Limulus polyphemus)，则会引起 血液凝固，该现象被用于内毒素的检测。 g卩，已知使用鲎血细胞提取液（鲎的变形细胞溶解物，下文中也称为"溶解物"）测 定内毒素的方法（例如，非专利文献1)。该方法被称为鲎试验，利用存在于溶解物中的各种 蛋白质的级联反应，该反应是通过使内毒素与溶解物接触而发生的。级联反应的示意图示 于图1。 在内毒素与溶解物接触后，存在于溶解物中的作为丝氨酸蛋白酶前体的因子C被 活化而生成活化型因子C。该活化型因子C使存在于溶解物中的因子B活化，生成活化型因 子B。该活化型因子B使存在于溶解物中的凝固酶原活化，生成凝固酶。 该凝固酶将存在于溶解物中的凝固蛋白原分子中的特定部位水解。由此，生成凝 固蛋白凝胶，以使溶解物凝固。因此，通过测定溶解物的凝固反应，可以测定内毒素。 此外，通过使凝固酶与合成底物发生作用，从而使显色反应进行，也可以测定内 毒素。例如，凝固酶作用于作为合成底物的叔丁氧羰基-亮氨酰基-甘氨酰基-精氨酰 基-pNA (Boc-Leu-Gly-Arg-pNA)，将其酰胺键水解，使PNA游离。由此，通过使反应体系中 存在所述合成底物，可以测定显色物质（PNA)的吸光度（405nm)，从而可以对内毒素进行定 量。 此外，已知的是，使用从日本鲎的溶解物纯化出的因子C、因子B及凝固酶原，可以 重构级联反应体系（非专利文献2)。 但是，为了利用溶解物或由此纯化出的因子C、因子B及凝固酶原，需要捕获鲎并 采集血液，从保护生物资源的观点出发，难以无限地供给这些成分。因此，需要通过基因工 程学的方式生产这些成分并重构级联反应体系的技术。 例如，已知下述例子：使用昆虫细胞作为宿主细胞来表达因子C、因子B及凝固酶 原，重构级联反应体系（专利文献1、2)。但是报道了：在该重构体系中，通过使反应体系中 存在氯化钠、硫酸镁或氯化钙，可抑制级联反应（专利文献1)。 另一方面，作为使用哺乳类细胞作为宿主细胞的例子，已知下述例子：使用非 洲绿猴肾细胞来源的细胞株COS-ι作为宿主细胞，表达新加坡豐（Carcinoscorpius rotundicauda，圆尾豐）来源的因子C。但是，在使用COS-I作为宿主细胞的情况下，据报道 所表达的因子C为不溶性（非专利文献3、4)。即，尚未知将哺乳类细胞用作宿主细胞来生 产功能性的因子C的例子。 现有技术文献 专利文献 专利文献1 :国际公开第2008/004674号小册子 专利文献2 :国际公开第2012/118226号小册子 非专利文献 非专利文献 I :Iwanaga S.，Curr. Opin. Immunol. Feb ;5 (1) : 74-82 (1993) 非专利文献 2 :Nakamura T.，et al.，J. Biochem. Mar ;99 (3) : 847-57 (1986) 非专利文献 3 :Roopashree S. Dwarakanath, et al.，Biotechnology lettersl9(4):357-361(1997) 非专利文献 4 : Jing Wang, Bow Ho and Jeak L. Ding, Biotechnology letters23:71-76(2001)
技术实现思路
专利技术要解决的问题 本专利技术的课题在于提供鲎的新重组因子C及制造该重组因子C的方法。 此外，注射至生物体内的注射剂大多含有各种盐（离子）。另一方面，在它们的制 造中，各国药典赋予了确认内毒素的义务。因此，本专利技术的一个方式的课题在于，提供一种 在盐（离子）的存在下难以受到反应抑制的级联反应的重构体系。 用于解决问题的方案 本专利技术人发现，通过将人细胞或中国仓鼠细胞用作宿主细胞，可以制造鲎的重组 因子C ;以及通过使用如此制造的重组因子C，可以在盐（离子）的存在下降低反应抑制，测 定内毒素，由此完成了本专利技术。 即，本专利技术包括以下的方案。 一种鲎的因子C，其具有因子C的活性。 上述因子C，其具有唾液酸。 上述因子C，其具有（α -2, 3)键的末端唾液酸。 上述因子C，其与天然因子C相比具有较多的（α-2,3)键的末端唾液酸。 上述因子C，其与将Sf9用作宿主细胞所表达的鲎的因子C相比，具有较多的 (α-2, 3)键的末端唾液酸。 上述因子C，其中，在用怀槐凝集素 （Maackia amurensis Agglutinin)进行凝集素 印迹时，与天然因子C相比显示出较高的反应性。 上述因子C，其中，在用怀槐凝集素 （Maackia amurensis Agglutinin)进行凝集素 印迹时，与将Sf9用作宿主细胞所表达的鲎的因子C相比显示出较高的反应性。 上述因子C，在21mM的柠檬酸钠的存在下，显示出10%以上的残留活性。 上述因子C，在21mM的柠檬酸钠的存在下，显示出20%以上的残留活性。 上述因子C，在52mM的碳酸氢钠的存在下，显示出25%以上的残留活性。 上述因子C，在52mM的碳酸氢钠的存在下，显示出35%以上的残留活性。 上述因子C，在214mM的氯化钠的存在下，显示出25%以上的残留活性。 上述因子C，在214mM的氯化钠的存在下，显示出35%以上的残留活性。 上述因子C，在16mM的硫酸镁的存在下，显示出15%以上的残留活性。 上述因子C，在16mM的硫酸镁的存在下，显示出25%以上的残留活性。 上述因子C，在2. 5mM的氯化钙的存在下，显示出35%以上的残留活性。 上述因子C，在2. 5mM的氯化钙的存在下，显示出45%以上的残留活性。 上述因子C，在21mM的柠檬酸钠的存在下，与将Sf9用作宿主细胞所表达的鲎的因 子C和/或天然因子C相比，显示出较高的残留活性。 上述因子C，在52mM的碳酸氢钠的存在下，与将Sf9用作宿主细胞所表达的鲎的因 子C和/或天然因子C相比，显示出较高的残留活性。 上述因子C，在214mM的氯化钠的存在下，与将Sf9用作宿主细胞所表达的鲎的因 子C和/或天然因子C相比，显示出较高的残留活性。 上述因子C，在16mM的硫酸镁的存在下，与将Sf9用作宿主细胞所表达的鲎的因子 C和/或天然因子C相比，显示出较高的残留活性。 上述因子C，在2. 5mM的氯化钙的存在下，与将Sf9用作宿主细胞所表达的鲎的因 子C和/或天然因子C相比，显示出较高的残留活性。 上述因子C，其为下述（A)、（B)、（C)、或（D)所示的蛋白质： (A)包含序列号2所不的氣基酸序列的蛋白质； (B)包含在序列号2所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鲎的因子C，其具有因子C的活性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：水村光，小田俊男，川畑俊一郞，
申请(专利权)人：生化学工业株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP