本发明专利技术“抗人神经生长因子的中和性单克隆抗体12C11及其杂交瘤细胞株”，涉及免疫学领域。抗人神经生长因子的中和性单克隆抗体，由保藏号为CGMCC No.8772的杂交瘤细胞所分泌，所述中和性单克隆抗体与人神经生长因子具有中和反应效应，其分类亚型为：重链IgG1、轻链Kappa。对人神经生长因子具有特异性中和活性，可作为人神经生长因子的拮抗剂。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及免疫学领域，具体地涉及抗人神经生长因子的单克隆抗体及其杂交瘤 细胞株。
技术介绍
神经生长因子（NGF)是具有神经元营养和促进突起生长双重生物学功能的一种 神经细胞生长调节因子，它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表 达均具有重要的调控作用。 研宄表明，神经生长因子（NGF)是一种在超敏反应的发生和异常性疼痛的产生中 具有关键作用的递质。大量临床前研宄表明：阻止NGF与其受体的相互作用，即可缓解疼 痛。NGF单克隆抗体与NGF中和，阻断NGF与其感觉神经元上的受体的相互作用从而达到缓 解疼痛的效果。（抗神经生长因子单克隆抗体Tanezumab.药学进展.2010, 34 (1):526.)。 有报道显示采用神经生长因子抗体拮抗剂来预防或治疗手术后疼痛，包括来自手术或来自 切割性或创伤性伤口的疼痛。还有报道显示抗NGF抗体用于治疗各种疾病，包括哮喘、关节 炎和银肩病（D.L.谢尔顿.抗NGF抗体用于治疗各种疾病.中国专利【申请号】02814992. 0)。 然而，目前对神经生长因子抗体的报道多是研宄多克隆抗体（赵小林，由振东.神经生长 因子抗体的制备及其应用.中国神经科学杂志.2004, 20 (2) : 171-173.)。而多克隆抗体的 特异性差，用于免疫组化时显色背景高，质量不易控制，难以在临床应用推广。单克隆抗体 具有特异性强、敏感性高的优点，在临床检测中应用广泛，可以在免疫组化、ELISA等多种方 法中使用。国内外对神经生长因子单抗的研宄并不常见。现已有报道得到的抗rhNGF单克 隆抗体是通过采用酸处理后的沙门氏菌菌体吸附纯化的NGF(抗原：菌体1 :5)脾内注射， 脾细胞与骨髓瘤细胞经PEG融合后筛选得到杂交瘤细胞，并对得到的抗rhNGF单克隆抗体 进行了初步的鉴定分析（苏瑾，张亚莉，尤长宣，等.抗人NGF单克隆抗体的制备及初步鉴 定.细胞与分子免疫学杂志.2002, 18 (2) : 168)，但没有对抗rhNGF单克隆抗体的中和活性 进行鉴定。因此，目前还需要获得一种特异性强、中和活性高的抗人NGF单克隆抗体，用于 临床疼痛的缓解和疾病的治疗。
技术实现思路
根据上述领域的需求，本专利技术提供一种抗人神经生长因子的中和性单克隆抗体及 其杂交瘤细胞株。 本专利技术请求保护的技术方案如下： 抗人神经生长因子的中和性单克隆抗体12C11，由保藏号为CGMCC No. 8772的杂 交瘤细胞所分泌，所述中和单克隆抗体与人神经生长因子具有中和反应效应，其分类亚型 为：重链IgGl、轻链Kappa。 分泌人神经生长因子中和性单克隆抗体12C11的杂交瘤细胞株，其保藏号为 CGMCCNo. 8773〇 基于本领域对于抗人神经生长因子的中和抗体的研宄，还请求保护上述抗体的以 下：制药用途： -种止痛药剂，其特征在于：其药效成分包含所述的中和性单克隆抗体12C11。 一种抗过敏药剂，其特征在于：其药效成分包含所述的中和性单克隆抗体12C11。 一种抗抗哮喘的药剂，其特征在于：其药效成分包含所述的中和性单克隆抗体 12C11。一种用于治疗银肩病的药剂，其特征在于：其药效成分包含所述的中和性单克隆抗 体 12C11。 一种鉴定抗神经生长因子NGF抗体的中和活性的方法，步骤如下： (1)用维持培养基配制抗体样品溶液，在预稀释浓度40 μ g/ml的基础上，进行2 倍系列稀释，共9个稀释度，将待测样品溶液转移至96孔板中，每个浓度3个复孔，每孔 50 μ 1，另选择3个孔加入不含抗体的培养基作为阴性对照，每孔100 μ 1 ; 所述 9 个稀释度分别为：10 μ g/ml、5 μ g/ml、2. 5 μ g/ml、l. 25 μ g/ml、0. 625 μ g/ ml、0. 3125 μ g/ml、0. 15625 μ g/ml、0. 078125 μ g/ml、0. 039063 μ g/ml ; (2)另用维持培养基配制200ng/ml的NGF蛋白溶液，将其添加至含有抗NGF抗体 样品溶液的96孔板中，每孔50 μ 1，阴性对照孔不添加 NGF培养基，另选择3个孔加入阳性 对照溶液l〇〇ng/ml NGF，每孔100 μ 1，然后将96孔板放置于37°C培养箱孵育Ih ; (3)取足量TF-I细胞培养物，离心收集TF-I细胞，PBS洗涤2次，离心收集的细胞 用维持培养基重悬，配成每1ml含5X IO4个细胞的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中含 有NGF蛋白及抗NGF抗体的孔、阴性对照孔和阳性对照孔中，每孔100 μ 1 ;将96孔板置于 37°C，5%二氧化碳培养；72h后，每孔加入MTS溶液20 μ 1，于37°C，5%二氧化碳培养3小 时； (4)从培养箱中取出96孔板，放入酶标仪，于波长490nm处测定吸光度，记录测定 结果； (5)通过待测制品的吸光度，按照公式：抗NGF抗体孔的中和抑制率（％) =[(阳 性孔0D490nm平均值-阴性孔0D490nm平均值）-(抗体孔0D490nm平均值-阴性孔0D490nm 平均值）V (阳性孔0D490nm平均值-阴性孔0D490nm平均值），计算每孔的中和抑制率， 中和抑制率越高，则抗NGF抗体的中和活性越强。 实验证明，本专利技术提供的抗人神经生长因子的中和单克隆抗体能够与人神经生长 因子特异性结合，具有中和反应活性，因此可以作为hNGF的拮抗剂。与现有的抗人神经生 长因子多克隆抗体相比，本专利技术提供的单抗特异性强，能够避免交叉反应，而且本专利技术提供 的单抗经过了中和活性的鉴定，其效价高、亲和力强、特异性好，能够与人神经生长因子发 生明显的中和反应。 本专利技术还请求保护分泌抗人神经生长因子的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其保藏 号分别为 CGMCC No. 8773。 另一方面，本专利技术还提供一种鉴定抗神经生长因子NGF抗体的中和活性的方法， 所述方法为TF-I细胞增殖法。本专利技术首次采用TF-I细胞增殖法检测抗NGF抗体的中和活 性，该方法可以准确、高效地检测出抗NGF抗体的中和活性，其原理是：NGF依赖的TF-I细 胞在NGF蛋白存在的条件下可以促进TF-I细胞增殖，然而在添加了 一定浓度的抗NGF抗体 后，抗NGF抗体与NGF发生中和作用，从而抑制TF-I细胞的良好生长，然后通过添加 MTS混 合溶剂细胞显色，在酶标仪上〇D490nm处测吸光度，计算每孔的中和抑制率，中和抑制率越 高，抗NGF抗体的中和活性也就越强。 生物保藏信息： 生物材料名称：12C11 分类命名：小鼠杂交瘤细胞 保藏日期：2014年1月16日 保藏号：CGMCC No. 8772 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 生物材料名称：IlFl 分类命名：小鼠杂交瘤细胞 保藏日期：2014年1月16日 保藏号：CGMCC No. 8773 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号【附图说明】 图1.免疫后小鼠血清效价检测结果 图2.抗hNGF单克隆抗体纯化效果的SDS-PAGE鉴定 图3.抗hNGF单克隆抗体蛋白的Western Blot本文档来自技高网...
【技术保护点】
抗人神经生长因子的中和性单克隆抗体12C11，由保藏号为CGMCC No.8772的杂交瘤细胞所分泌，所述中和单克隆抗体与人神经生长因子具有中和反应效应，其分类亚型为：重链IgG1、轻链Kappa。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘荷中，霍立红，何景昌，乐伟，史权威，
申请(专利权)人：北京华安科创生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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