本发明专利技术提供了一种产莽草酸的谷氨酸棒杆菌，包含aroG、aroB、aroD和aroE基因，还包含调控所述aroG基因表达的RBS1、调控aroB基因表达的RBS2、调控aroD基因表达的RBS3和调控aroE基因表达的RBS4；RBS1的基因序列为SEQ ID NO:1所示，RBS2的基因序列为SEQ ID NO:2所示，RBS3的基因序列为SEQ ID NO:3所示，RBS4的基因序列为SEQ ID NO:4所示。本发明专利技术还提供了一种构建上述产莽草酸的谷氨酸棒杆菌的方法及应用。本发明专利技术通过选择适当的RBS序列调整莽草酸表达途径中aroG、aroB、aroD、aroE基因的表达量，大大提高了莽草酸的产量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物
，具体涉及一种产莽草酸的谷氨酸棒杆菌及其构建方 法与应用。
技术介绍
莽草酸（3, 4, 5-trihydroxy-1-cyclohexene-1-ca;rboxylic acid, shikimic acid，SA)呈白色晶体状，比旋光度 = -157° XcmVgXdnT1，最大紫外吸收在235nm， 其具有多种同分异构体，但只有α型的同分异构体具有生物学活性。莽草酸除可用于合成 苯丙氨酸、络氨酸、色氨酸外，还可用于合成维生素、己二酸等化合物。莽草酸可以通过化学 合成、微生物发酵、植物萃取等手段获得。传统的莽草酸生产主要通过植物萃取进行，植物 八角茴香的果实是工业上获得莽草酸的主要来源。但由于八角茴香仅分布在全球极少数地 区，其产量受气候、自然环境等因素的影响，因此严重限制了莽草酸的产量。化学合成莽草 酸由于产率不高、工艺复杂、价格高昂因而未能广泛开展。利用微生物发酵生产莽草酸具有 操作简单、能耗小、生产成本及低无污染等优点，在当今资源需求量较大、能源紧张、环保要 求不断提高的情况下，展现了特有的优越性和广阔的发展空间。 现有的产莽草酸的菌株主要是通过对莽草酸途径基因改造的方式过表达途径中 的aroG、aroB、aroD、aroE四个基因，虽然经过以上方法改造的菌株可以在一定条件下提升 莽草酸的生产效率，但对莽草酸途径的改造策略只强调了过表达途径中的基因，而在翻译 水平使用相同的RBS元件来控制基因的表达，限制了对莽草酸表达能力的进一步提高。例 如：Chen等人对大肠杆菌进行改造，其菌株的莽草酸产量仅为1.85g/L (Chen K，Dou J，Tang S, Yang Y, Wang Η, Fang Η, Zhou C(2012)Deletion of the aroK gene is essential for high shikimic acid accumulation through the shikimate pathway in E.coli. Bioresour Technol 119:141-7)。Cui等人对大肠杆菌进行改造，其菌株的莽草酸产量也 仅为 3. 12g/L(Cui YYjLing CjZhang YYjHuang JjLiu JZ(2014)Production of shikimic acid from Escherichia coli through chemically inducible chromosomal evolution and cofactor metabolic engineering. Microb Cell Fact 13:21)〇
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，通过选 择适当的RBS序列调整莽草酸表达途径中aroG、aroB、aroD、aroE基因的表达量，从而大大 提高莽草酸的产量。 本专利技术提供一种产莽草酸的谷氨酸棒杆菌，包含aroG、aroB、aroD和aroE基因，还 包含调控aroG基因表达的RBS1、调控aroB基因表达的RBS2、调控aroD基因表达的RBS3 和调控aroE基因表达的RBS4 ;aroG的基因序列为SEQ ID N0:6所示，aroB的基因序列为 SEQ ID NO: 7所示，aroD的基因序列为SEQ ID NO:8所示，aroE的基因序列为SEQ ID NO:9 所示； 在上述技术方案中，RBS1的基因序列为SEQ ID NO :1所示，RBS2的基因序列为SEQ ID NO: 2所示，RBS3的基因序列为SEQ ID NO: 3所示，RBS4的基因序列为SEQ ID NO:4所 不O 在上述技术方案中，aroB基因与aroD基因之间还插入有终止子2,终止子2的基 因序列为SEQ ID NO: 11所示。 在上述技术方案中，还包含RiboJ基因，RiboJ的基因序列为SEQ ID NO: 5所示。 在上述技术方案中，aroG基因与aroG基因的启动子之间插入有RiboJ基因，所述 ar〇B基因与aroB基因的启动子之间插入有RiboJ基因、所述aroD基因与aroD基因的启动 子之间插入有RiboJ基因，所述aroE基因与aroE基因的启动子之间插入有RiboJ基因。 本专利技术还提供了一种产莽草酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法，包括如下步骤： 1)将 aroG、aroB、aroD 和 aroE 基因分别插入载体 pXMJ19,得到载体 pXMJ19_aroG、 pXMJ19-aroB、pXMJ19-aroD、pXMJ19_aroE ; 2)将aroG中的HindIII和PstI酶切位点，aroB中的BamHI和SpeI酶切位点，aroD 中的PstI酶切位点，aroE中的EcoRI和Sail酶切位点进行突变，得到载体pXMJ19-aroGm、 pXMJ19-aroB?、pXMJ19-aroDm、pXMJ19-aroE?; 3)将RiboJ基因插入载体pXMJ19,得到载体pXMJ19-RiboJ ; 4)将荧光蛋白基因插入载体pXMJ19_Rib〇J，得到载体pZB ; 5)用引物MU-RBSAG-F和MU-RBSAG-R以pXMJ19-aroG?为模板扩增基因片段 aroG?，用引物 MU-RBSAB-F 和 MU-RBSAB-R 以 pXMJ19-aroBm为模板扩增基因片段 aroB m， 用引物MU-RBSAD-F和MU-RBSAD-R以pXMJ19-aroD?为模板扩增基因片段aroD ?，用引物 MU-RBSAE-F 和 MU-RBSAE-R 以 pXMJ19-aroEm为模板扩增基因片段 aroE 6)将步骤5)中扩增的基因片段&1'〇6' &1^'&1'〇0?和&1^"11分别插入载体？28， 得到载体 pZB-aroG、pZB-aroB、pZB-aroD 和 pZB-aroE ; 7)步骤6)得到的载体分别转化大肠杆菌，对得到的克隆进行测序，将测序无 误的载体 pZB-aroG、pZB-aroB、pZB-aroD 和 pZB-aroE 共同转化至 Corynebacterium glutamicumAaroK中，培养并检测焚光强度； 8)用引物 aroG-H-F、aroG-H-R 以 pXMJ19-aroG?为模板扩增基因片段 aroG-Η 并 插入载体pXMJ19-RiboJ，得到载体ρΧΜΙΙΘ-Κ?^οΙ-ΒΓοΟ^-Η ;所述aroG-Η的基因序列如SEQ ID NO: 13 所示； 9)用引物 aroB-M-F、aroB-M-R 以 pXMJ19-aroB?为模板扩增基因片段 aroB-Μ ;用 aroD-M-F、aroD-M-R 以 pXMJ19-aroD?为模板扩增基因片段 aroD-Μ ;用 aroE-M-F、aroE-M-R 以pXMJ19-aroE?为模板扩增基因片段aroE-Μ ;将扩增的基因片段aroB-M、aroD-Μ和 aroE-Μ 插入载体 pXMJ19-RiboJ，获得载体 pXMJig-RiboJ-aroB^-MjXMJig-RiboJ-aroD^-M 和 pXMJ19本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种产莽草酸的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，包含aroG、aroB、aroD和aroE基因，还包含调控所述aroG基因表达的RBS1、调控所述aroB基因表达的RBS2、调控所述aroD基因表达的RBS3和调控所述aroE基因表达的RBS4；所述aroG的基因序列为SEQ ID NO:6所示，所述aroB的基因序列为SEQ ID NO:7所示，所述aroD的基因序列为SEQ ID NO:8所示，所述aroE的基因序列为SEQ ID NO:9所示；所述RBS1的基因序列为SEQ ID NO:1所示，所述RBS2的基因序列为SEQ ID NO:2所示，所述RBS3的基因序列为SEQ ID NO:3所示，所述RBS4的基因序列为SEQ ID NO:4所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘双江，张博，姜成英，周楠，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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