本发明专利技术属于植物病害的分子检测领域，具体涉及一种降香黄檀黑痣病菌的分子检测引物及其检测方法。采用设计出的一对降香黄檀黑痣病菌特异引物经过巢式PCR扩增，PCR产物扩增分析，琼脂糖凝胶电泳和结果判定。若样本中存在黄檀黑痣菌，在紫外光下琼脂糖凝胶中会出现一条273bp的目的条带，若未出现条带，则代表不存在黄檀黑痣菌。本发明专利技术的引物特异性强，可以区分黄檀黑痣菌、禾草黑痣菌、刚竹黑痣菌以及分离自降香黄檀、大果紫檀的其他病原菌及内生真菌；该引物灵敏度高，可检测下限至100ag/μL的黄檀黑痣菌基因组DNA；本发明专利技术快速，8小时内即可得到准确的检测结果，而利用传统的病害诊断方法至少需要4天或1周以上。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物病害的分子检测领域，具体涉及一种降香黄檀黑痣病菌分子检测 引物及其检测方法，可用于降香黄檀黑痣病的早期诊断和病菌的监测与鉴定。
技术介绍
降香黄檀是海南省热带珍贵乡土树种之一，为国家二级保护树种，在我们国家标 准的5属8类34种红木中，是仅次于紫檀类的红木。其材质硬重，强度大，干燥不开裂，不 变形，结构均匀，是制造名贵家具、工艺品、乐器、雕刻和名贵装饰的上等用材。 随着海南省降香黄檀人工林种植面积不断增加，病虫害问题日益突出。降香黄檀 黑痣病是由黄檀黑痣菌引起的，是降香黄檀苗期和幼树期的主要病害。海南省高温高湿 的气候特点，使降香黄檀全年遭受黑痣病的侵害，常年发病率达45 %~65 %，严重时可达 80%以上。该菌所致病害会在寄主表面形成黑色凸起的盾片，发病后期盾片覆满整个寄主 叶片表面，严重影响植物的光合作用，致使其提前落叶。 黄檀黑痣菌可侵染寄主的叶、枝、茎、荚果等地上部分，病菌主要以菌丝体在病叶 或病落叶上越冬，成为次年的初次侵染来源。春末、夏初天气潮湿多雨，病菌开始侵染，在适 宜的温湿度条件下，黄檀黑痣菌产生的子囊孢子迅速繁殖，借助风雨迅速传播侵染附近的 植株，形成发病中心。发病后期，被侵染的植株，整株叶片和枝条上会覆满大量的黑疲，刚萌 发的新叶亦受侵染发病。遇暴雨台风天气，台风造成降香黄檀叶片、果实等损伤，病原菌即 从微伤口侵入，且台风期的高温天气加之台风后的暴雨，林间积水严重，加上便于侵入的微 伤口导致黑痣病的爆发。 目前，国内学者对降香黄檀黑痣病菌研宄涉及的较少，在分子水平的研宄更是鲜 有报道。传统植物病害诊断方法需要经过病原菌分离、培养、鉴定等过程，耗时长、工作量 大，可能会错过病害防治的最佳时期。且由于黑痣属真菌是一类专性寄生的活体营养真菌， 即它不能够在培养基上生长，因而不能用组织分离法分离出病原菌，给该病害的准确诊断 带来了极大的困难。因此，建立一套结果可靠、易于操作、灵敏度高的黄檀黑痣菌分子检测 技术，对病害发生情况进行预报预测，对及时采取有效的防治措施控制病原菌的进一步发 生有着非常重要的理论和实际意义。 随着分子生物学技术的发展，以聚合酶链式反应（PCR)技术为代表的分子检测方 法得到了迅速的发展和应用。由于核糖体基因 ITS序列在真菌种间的高度变异和种内的稳 定性，为病原物的分子检测提供了理想的靶序列。相较于传统的病害诊断技术，巢式PCR技 术在灵敏度、检出率及专一性方面均有了很大的提高，且不需要进行病原菌的分离培养等 特点。本文依据rDNA的ITS序列在真菌种内保守性和种间变异性的特点，通过设计针对黄 檀黑痣菌特异性引物，结合真菌通用引物ITS4/ITS5对降香黄檀基因组DNA进行巢式PCR 扩增，在降香黄檀黑痣病表现出明显症状之前将黄檀黑痣菌快速、准确地检测出来，为该病 害的早期诊断和预防提供行之有效的技术方案。
技术实现思路
针对现有技术中降香黄檀黑痣病菌还没有系统的分子检测方法的现状，本专利技术提 供了一种降香黄檀黑痣病菌分子检测引物以及降香黄檀黑痣病菌的快速检测方法。 为了实现上述目的，本专利技术采取了以下技术方案： 一种降香黄檀黑痣病菌分子检测引物，序列如下： 上游引物：Pl: 5' -CGAGGTCAGAATCAAACG-3' 下游引物：P2:5' -TGAAGAACGCAGCGAAAT-3'。 一种降香黄檀黑痣病菌的快速分子检测方法，包括下列步骤： 1)提取降香黄檀叶片基因组DNA ; 2)巢式PCR反应： 第一轮PCR反应：以ITS4/ITS5为引物进行第一轮PCR ;第二轮PCR反应：以Pl/ P2为引物进行第二轮PCR反应， 上游引物：Pl: 5' -CGAGGTCAGAATCAAACG-3' 下游引物：P2:5' -TGAAGAACGCAGCGAAAT-3' ； 3) PCR扩增产物分析 取步骤2)扩增产物，经溴化乙锭染色后在凝胶成像系统上成像； 4)结果判定 根据扩增产物的大小判定结果，如果能特异性地扩增出273bp的产物，即可判断 植物组织中存在黄檀黑痣菌。 步骤2)巢式PCR反应第一轮PCR反应： 以ITS4/ITS5为引物进行第一轮PCR，扩增反应体系为：2XTaq PCR MasterMix 12. 5 μ L，步骤1)制备的降香黄檀叶片总DNA 1 μ L，10 μmol/L上游引物及下游引物各 1 μ L，最后用CldH2O补足至25 μ L，离心15sec后置于PCR仪中进行扩增；PCR反应条件为： 94°C预变性4min ;94°C变性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸lmin，共35个循环；72°C延伸 IOmin0 所述的引物ITS4/ITS5序列如下： ITS4 :5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' ； ITS5 :5,-GGA AGGTAA AAG TCA AGG-3, 。 步骤2)巢式PCR反应第二轮PCR反应： 以P1/P2为引物进行第二轮PCR反应，扩增反应体系为：2XTaq PCR MasterMix 12.5 41^、141^第一轮？〇?扩增产物、1(^111〇1/1引物？1/?2各141^，最后用(1(1!120补足至 25 μ L，离心15sec后置于PCR仪中进行扩增；PCR反应条件为：94°C预变性4min ;94°C变性 30sec，56°C退火 30sec，72°C延伸 lmin，共 35 个循环；72°C延伸 IOmin0 步骤3) PCR扩增产物分析：取步骤2)扩增产物4 μ L，用I X TAE作为电泳缓冲液， 在1. 0%琼脂糖凝胶上，5V/cm电压采用进行电泳检测，经溴化乙锭染色后在凝胶成像系统 上成像。 步骤 3)所述的电泳缓冲液（50XTAE)成分为：Tris242g，Na2EDTA · 2H20 37. 2g， 加入800ml去离子水，加入57. Iml醋酸，充分搅拌后定容至IL ;工作浓度为I X TAE。 本专利技术设计了一对黄檀黑痣菌特异性引物，并成功建立了一种降香黄檀黑痣病发 病早期的快速检测方法。与其他检测方法相比，本专利技术具有以下优点： 1.采用本专利技术，可以特异性检测出黄檀黑痣菌。本专利技术设计的特异性引物可以区 分分离自降香黄檀及大果紫檀的病原菌及内生真菌，参见附图1。 2.采用本专利技术，可以检测出IOOag/ μ L的黄檀黑痣菌DNA，相较于常规的微生物检 测方法其灵敏度较高。 3.采用本专利技术方法检测十分快速，8个小时内就可以检测出降香黄檀是否已经受 到黄檀黑痣菌的侵染，该技术的应用对降香黄檀黑痣病的早期检测、提早预防具有十分重 要的意义。【附图说明】 图1是本专利技术所设计特异性引物对黄檀黑痣菌总DNA的扩增图谱， 泳道M :2000bp DNA marker，分子量标准从上到下依次为：2000bp、1000bp、750bp、 500bp、273bp、100bp(为天根生化科技公司产品，目录号：MD114-02); 泳道1-11分别为表1所述采集自9个市县的黄檀黑痣菌：样本BOl、B04-B09各提 供1份，B02、B03各提供2份（见表1)。 图2是本专利技术所设计特异性引物对黄檀黑痣菌及其他真菌分离物总DNA的扩增图本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种降香黄檀黑痣病菌分子检测引物，其特征在于，序列如下：上游引物：P1:5'‑CGAGGTCAGAATCAAACG‑3'下游引物：P2:5'‑TGAAGAACGCAGCGAAAT‑3'。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周国英，刘君昂，董文统，何苑嗥，刘倩丽，刘成锋，
申请(专利权)人：中南林业科技大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43
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