一种裂殖壶菌藻粉中DHA含量的测定方法技术

本发明专利技术公开了一种裂殖壶菌藻粉中DHA含量的测定方法，所述的测定方法包括：准备标准溶液和裂殖壶菌藻粉样品，以十三烷酸内标溶液为内标物，对加入有内标物的裂殖壶菌藻粉样品提前油脂、皂化、甲酯化后制备得到供试品溶液，使用气相色谱仪进行检测，测定结果以样品峰的保留时间与脂肪酸甲酯标准品的保留时间定性，并按内标法计算各脂肪酸的含量，具有样品处理简单，操作简便、快速的特性，测定结果重现性好、可行度高，并为裂殖壶菌藻粉DHA的质量控制提供了检测方法依据。

【技术实现步骤摘要】
一种裂殖壶菌藻粉中DHA含量的测定方法
本专利技术是一种裂殖壶菌藻粉中DHA含量的测定方法，具体涉及裂殖壶菌中不饱和脂肪酸DHA的定量测定，属于不饱和脂肪酸的检测

技术介绍
脂肪酸是细胞的重要组成部分，不仅为细胞活动提供能量，含有3～5个双建的多不饱和脂肪酸还是前列腺素和白细胞三烯的合成前体，据研究表明，α-亚麻酸、二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）等n-3多不饱和脂肪酸还具有抗发炎、抗血栓、抗心律失常、降血脂和软化血管等作用。n-3多不饱和脂肪酸的主要来源有植物油，例如：例如:菠菜、马齿苋、亚麻的种子、亚麻仁以及胡桃等，其中以亚麻籽油中含α-亚麻酸(高达57%)最多，其次是菜籽油、大豆油和小麦胚芽油(7%～13%)；其他来源包括一些坚果、种子、蔬菜和水果、蛋黄、禽肉，其中，鱼类是主要的EPA和DHA来源；除此之外，海洋微生物以及一些藻类植物也是多不饱和脂肪酸的良好来源，裂殖壶菌即是其中一种。裂殖壶菌（Schizochytrium）作为一类藻类的海洋真菌，该菌易培养、生长快，已实现工业化生产，其细胞内积累了大量的油脂，90%以上油脂以人体易吸收的甘油三脂（TG）形式存在，不饱和脂肪酸含量很高，主要为DHA，其它多不饱和脂肪酸含量很低。毒性3+试验证明使用裂殖壶菌作为食品添加剂饲喂大鼠、兔和猪是安全可靠的，其安全性已得到美国FDA的认可。目前，壶菌藻粉作为一种理想的DHA新生资源，已广泛应用于食品、药品和保健品。国内外公开报道裂殖壶菌藻粉文献较多，大多集中在裂殖壶菌的工业化生产、油脂提取、营养成分分析等，如《裂殖壶菌DHA提取方法的优化和工业化应用》（南京科技大学，硕士论文，dingweicui，2012.05）记载的对微生物油脂的提取方法，和《富含DHA的裂殖壶菌的工业化生产试验、脂肪酸提取及应用研究》（中国海洋大学，博士学位论文，宋晓金，2008.06.01）记载的工业化生产及脂肪酸的提取技术，但关于裂殖壶菌藻粉中DHA的定量测定，尚未见公开报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种裂殖壶菌藻粉中DHA含量的测定方法，该测定方法是对裂殖壶菌藻粉中提取的油脂进行的气相色谱检测，使用气相色谱内标法定量测定油脂中的脂肪酸含量，具有样品处理简单，操作简便、快速的特性，测定结果重现性好、可行度高，并为裂殖壶菌藻粉DHA的质量控制提供了检测方法依据。本专利技术通过下述技术方案实现：一种裂殖壶菌藻粉中DHA含量的测定方法，所述的测定方法包括以下步骤：A：备样，取标准溶液和裂殖壶菌藻粉样品，在裂殖壶菌藻粉样品中加入内标物和盐酸，混合后提取油脂，所述的内标物为十三烷酸内标溶液，所述的标准溶液选用Supelco37种脂肪酸甲酯混合标准溶液，其浓度为10mg/mL；B：制备供试品溶液，将步骤A提取的油脂依次皂化、甲酯化后制得脂肪酸甲酯溶液，在脂肪酸甲酯溶液中加入异辛烷和饱和NaCl溶液，经混合、静置分层后，移取上层清液，脱水后制得供试品溶液，备用；C：测定，分别移取等量的供试品溶液和标准溶液1μL，注入气相色谱仪中进行测定，测定条件包括：色谱柱：石英毛细管柱，柱温：60～240℃，检测器：氢火焰离子化检测器，检测器温度：250～270℃，汽化室温度：240～260℃；气体流量：载气为高纯氮，流速0.8～1.2mL/min，空气流速300～400mL/min，氢气流速30～40mL/min，分流比：（5～20）：1。本专利技术方法操作简便、快速、重复性好，适合于批量裂殖壶菌藻粉样品脂肪酸的定量测定。裂殖壶菌藻粉样品中的油脂提取后，经皂化、甲酯化后衍生为相应的脂肪酸甲酯，制备成供试品溶液后，以石英毛细管柱分离，氢火焰离子化检测器测定，以样品峰的保留时间与脂肪酸甲酯标准品的保留时间定性，按内标法计算各脂肪酸的含量，测定结果表明，在本专利技术涉及的色谱条件下，37种脂肪酸甲酯在65min内均获得较好的分离。在本专利技术中，内标物选用浓度为10.0mg/mL的十三烷酸内标溶液，具有测定结果重现性好、可信度高等良好的使用效果，当然，为提高内标物的使用效果，在所述的步骤A中，所述盐酸的浓度为4mol/L，所述裂殖壶菌藻粉样品、内标物、盐酸的质量比为（0.2～0.8）：（4～6）：（4～6）。在所述的步骤A中，油脂的提取包括：A.1：将裂殖壶菌藻粉样品、内标物、盐酸的混合物依次进行恒温振荡、沸水浴加热和速冷降温后，制得样品溶液，盐酸浓度为4mol/mL，通常使用漩涡混匀1min后，再送至水槽进行恒温振荡；A.2：在步骤A.1制得的样品溶液中加入体积比为1:1的三氯甲烷—甲醇混合溶剂，混合均匀后进行离心操作，取氯仿层备用；A.2：在步骤A.2制得的氯仿层加入等体积的0.1%氯化钠溶液，混合均匀后进行离心操作，取氯仿层，移至干燥瓶中旋转蒸发，蒸发后得到油脂。在所述的步骤A.1中，恒温振荡时，温度控制在50～70℃，振荡30～50min，振荡频率80～120次/min；沸水浴的加热时间为4～6min；使用-10～-30℃的温度进行速冷降温。所述离心操作的时间控制在8～12次/min，转速控制在4000～6000r/min。在所述的步骤B中，脂肪酸甲酯溶液的制备包括：B.1：皂化，在步骤A提取的油脂中加入0.5mol/L的氢氧化钾—甲醇，充N2，水浴加热并回流；B.2：甲酯化：回流8～12min后，加入13～15%的三氟化硼-甲醇，水浴加热并回流15～30min后，制得脂肪酸甲酯溶液。皂化反应方式式如下：甲酯化反应方程式如下：制得的脂肪酸甲酯溶液为二十二碳六烯酸甲酯，其结构式为：在所述的步骤B中，异辛烷加入沸腾的脂肪酸甲酯溶液中，停止加热后，再加入饱和NaCl溶液，脂肪酸甲酯溶液、异辛烷、饱和NaCl溶液的质量比为（40～60）：（40～60）：（15～30），加入异辛烷的目的是：异辛烷作为弱极性溶剂，经过涡旋混合，待测的二十二碳六烯酸甲酯（DHA）全部从KOH-三氟化硼-甲醇混合溶液中转移到异辛烷中；加入饱和NaCl溶液目的是：为了使异辛烷溶液与KOH-三氟化硼-甲醇-水混合溶液完全分层，在实现上述过程时，脂肪酸甲酯溶液、异辛烷、饱和NaCl溶液的使用量应按照上述质量比范围严格操作，才能保证操作过程的顺利进行。在所述的步骤C中，气相色谱仪的测定条件中，色谱柱的初始温度为60℃，以4℃／min升至160℃后，再以2℃／min升至240℃，其目的是：通过程序升温，保证裂殖壶菌藻粉脂肪酸分离度完全满足定量测定需要。进一步的，所述气相色谱仪的测定条件中：色谱柱为SupelcoSPTM-2560石英毛细管柱，100m×0.25mmi.d.×0.20μm；检测器为氢火焰离子化检测器，检测器温度为260℃；汽化室温度：250℃；气体流量：载气为高纯氮，流速1.0mL/min，空气流速350mL/min，氢气流速35mL/min；柱流速：1.0mL/min；尾吹流速：40mL/min；分流比：10：1。本专利技术与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：（1）本专利技术是以十三烷酸为内标物，采用气相色谱定量测定裂殖壶菌藻粉中的脂肪酸（DHA）的检测方法，测定结果以样品峰的保留时间与脂肪酸甲酯标准品的保留时间定性，并按内标法计算各脂肪酸的含量，具有样品本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种裂殖壶菌藻粉中DHA含量的测定方法，其特征在于：所述的测定方法包括以下步骤：A：备样，取标准溶液和裂殖壶菌藻粉样品，在裂殖壶菌藻粉样品中加入内标物和盐酸，混合后提取油脂，所述的内标物为十三烷酸内标溶液；B：制备供试品溶液，将步骤A提取的油脂依次皂化、甲酯化后制得脂肪酸甲酯溶液，在脂肪酸甲酯溶液中加入异辛烷和饱和NaCl溶液，经混合、静置分层后，移取上层清液，脱水后制得供试品溶液，备用；C：测定，分别移取等量的供试品溶液和标准溶液1μL，注入气相色谱仪中进行测定，测定条件包括：色谱柱：石英毛细管柱，柱温：60～240℃，检测器：氢火焰离子化检测器，检测器温度：250～270℃，汽化室温度：240～260℃；气体流量：载气为高纯氮，流速0.8～1.2mL/min，空气流速300～400mL/min，氢气流速30～40mL/min，分流比：（5～20）：1。

【技术特征摘要】
1.一种裂殖壶菌藻粉中DHA含量的测定方法，其特征在于：所述的测定方法包括以下步骤：A：备样，取标准溶液和裂殖壶菌藻粉样品，在裂殖壶菌藻粉样品中加入内标物和盐酸，混合后提取油脂，所述的内标物为十三烷酸内标溶液；B：制备供试品溶液，将步骤A提取的油脂依次皂化、甲酯化后制得脂肪酸甲酯溶液，在脂肪酸甲酯溶液中加入异辛烷和饱和NaCl溶液，经混合、静置分层后，移取上层清液，脱水后制得供试品溶液，备用；C：测定，分别移取等量的供试品溶液和标准溶液1μL，注入气相色谱仪中进行测定，测定条件包括：色谱柱：石英毛细管柱，柱温：初始温度为60℃，以4℃／min升至160℃后，再以2℃／min升至240℃，检测器：氢火焰离子化检测器，检测器温度：250～270℃，汽化室温度：240～260℃；气体流量：载气为高纯氮，流速0.8～1.2mL/min，空气流速300～400mL/min，氢气流速30～40mL/min，分流比：（5～20）：1,在所述的步骤A中，所述盐酸的浓度为4mol/L，所述裂殖壶菌藻粉样品、内标物、盐酸的质量比为（0.2～0.8）：（4～6）：（4～6），在所述的步骤A中，油脂的提取包括：A.1：将裂殖壶菌藻粉样品、内标物、盐酸的混合物依次进行恒温振荡、沸水浴加热和速冷降温后，制得样品溶液；A.2：在步骤A.1制得的样品溶液中加入体积比为1:1的三氯甲烷—甲醇混合溶剂，混合均匀后进行离心操作，取氯仿层备用；A.3：在步骤A.2制得的氯仿层加入等体积的0.1%氯化钠溶液，混合均匀后进行离心操作，取氯仿层，蒸发后得到油脂。2.根据权利要求1所述的一种裂殖壶菌藻粉中DHA含量的测定方...

【专利技术属性】
技术研发人员：张凤枰，罗彬月，杜雪莉，刘耀敏，
申请(专利权)人：通威股份有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51