一种DNA聚合酶错配率的检测方法技术

本发明专利技术公开一种DNA聚合酶错配率的检测方法，包括如下步骤：1)制备含有突变型ccdB基因的质粒，其中所述突变型ccdB基因是通过同义突变在野生型ccdB基因内引入内切酶的酶切位点，所述酶切位点在所述质粒上是唯一的；2)内切酶酶切，获得线性化质粒；3)扩增LacZα基因；4)将步骤3)获得的LacZα基因连接到所述线性化质粒，获得连接产物；5)转化上述连接产物至宿主菌，并在培养基上进行培养；6)计算错配率。本发明专利技术提供的方法，具有操作简单、快速且成本低的特点。

【技术实现步骤摘要】
一种DNA聚合酶错配率的检测方法
本专利技术涉及一种生物学检测方法。更具体地，涉及一种酶学检测方法。
技术介绍
DNA聚合酶保真性检测的经典方法，是利用蓝白斑显色的方法，以蓝白斑比例的形式反映DNA聚合酶扩增LacZα基因时的突变率，来衡量DNA聚合酶保真性。最传统的方法是利用λ噬菌体携带扩增的LacZα基因，感染细胞后进行蓝白斑显色，例如KellyS.Lundberg等(High-fidelityamplificationusingathermostableDNApolymeraseisolatedfromPyrococcusfuriosus,1991,Gene)、JaniceCline等(PCRfidelityofPfuDNApolymeraseandotherthermostableDNApolymerases,1996,NucleicAcidsResearch)。该方法操作繁琐，且有造成实验室发生噬菌体污染的风险。也有学者开发出基于质粒而非噬菌体的检测方法，如StanislawK等(Plasmid-basedLacZαassayforDNApolymerasefidelity:applicationtoarchaealfamily-BDNApolymerase,2009,NucleicAcidsResearch)、BrianJ.Keith等(Aplasmid-basedlacZαgeneassayforDNApolymerasefidelitymeasurement,2013,AnalyticalBiochemistry)。但这些方法都要用到切刻内切酶，制备含有单链区域的质粒(即“GappedDNA”)，实验步骤较为繁琐。另有学者扩增含有部分抗性基因片段的LacZα基因，然后利用载体与片段间抗性基因的功能性互补消除背景干扰，如WayneM.Barne等(ThefidefityofTaqpolymerasecatalyzingPCRisimprovedbyanN-terminaldeletion,1992,Gene)。但该方法扩增插入片段时，可能在抗性基因片段上出现突变，使得重组质粒无法正常生长，导致克隆数减少，低估DNA聚合酶的错配率。因此，需要提供一种操作简便、准确的DNA聚合酶错配率的检测方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的第一个技术问题是提供一种操作简便、准确的DNA聚合酶错配率的检测方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用下述技术方案：一种DNA聚合酶错配率的检测方法，该方法包括如下步骤：1)制备含有突变型ccdB基因的质粒，其中所述突变型ccdB基因是通过同义突变在野生型ccdB基因内引入内切酶的酶切位点，所述酶切位点在所述质粒上是唯一的；2)内切酶酶切，获得线性化质粒；3)扩增LacZα基因；4)将步骤3)获得的LacZα基因连接到所述线性化质粒，获得连接产物；5)转化所述连接产物至宿主菌，并在培养基上进行培养；6)计算错配率。本专利技术所述同义突变是指：通过突变获得与野生型ccdB基因(见序列表SEQIDNo.2)DNA序列不同的突变型ccdB的DNA序列，但是突变型ccdB基因编码的ccdB蛋白序列与野生型ccdB基因编码的蛋白序列相同。同义突变的目的是为了在野生型ccdB基因的DNA序列内引入内切酶的酶切位点，即突变型ccdB基因具有内切酶酶切位点。突变型ccdB基因通过同义突变获得的酶切位点应该在步骤1)所述的质粒上是唯一的。优选地，酶切位点位于突变型ccdB基因序列中间靠近5’端部分。优选地，酶切位点为高效内切酶识别的位点。本专利技术方法的原理是：ccdB基因是致死基因，其编码毒素蛋白ccdB，含有ccdB基因的质粒转入对ccdB蛋白无抗性的宿主菌体，将会导致宿主菌体的死亡。LacZα基因编码β-半乳糖苷酶(简称β-gal)。β-gal比较稳定，用X-Gal为底物进行染色时，呈蓝色。LacZα基因插入突变型ccdB基因中，破坏了突变型ccdB基因的编码序列，使其不能表达ccdB蛋白(如图1和6所示)。DNA聚合酶扩增LacZα基因，并将其连接到含有突变型ccdB基因的质粒中，然后将质粒转入对ccdB蛋白无抗性的宿主菌体。当LacZα基因不能插入到突变型ccdB基因时，突变型ccdB基因表达ccdB蛋白，会造成宿主菌体的死亡；当LacZα基因插入到突变型ccdB基因时，突变型ccdB基因不表达ccdB蛋白，而表达β-gal，如果LacZα基因无突变，用X-Gal为底物进行染色时，呈蓝色(蓝斑)，如果LacZα基因有突变，用X-Gal为底物进行染色时，呈白色(白斑)，白斑数量与蓝斑数量之和为总菌斑数量。白斑数量越多，则DNA聚合酶的错配率越高，反之则越低。错配率直接反映DNA聚合酶的保真性—错配率越高，保真性越低。因此可以直接将错配率作为保真性的评价指标。在PCR体系与条件相同的情况下，用不同PCR酶扩增LacZα基因(如图5所示)并完成上述实验，便可以根据数据比较不同DNA聚合酶的保真性。即DNA聚合酶的错配率计算方法为：(1-错配率)碱基数×循环数＝蓝斑数/总菌斑数将上式变形，最终可得：其中，步骤(1)中含有突变型ccdB基因的质粒构建方法可采用常规的构建方法，如对含有野生型ccdB基因的质粒进行点突变，或通过PCR的方法突变野生型ccdB基因以获得突变型ccdB基因，然后将突变型ccdB基因的PCR产物或其内切酶酶切产物连接到载体上，或者通过基因重组的方法连接到载体上，或者其他能够实现相同目的的实验手段，其中所述载体不含有可表达ccdB蛋白的基因，或可表达与ccdB蛋白相同功能产物的基因。优选地，步骤4)所述LacZα基因连接到所述线性化质粒的方法为基因重组或通过DNA连接酶连接。通过基因重组，所述LacZα基因插入到突变型ccdB基因中。其中所述LacZα基因的DNA序列见序列表SEQIDNo.1。优选地，步骤1)所述的质粒不表达抗ccdB蛋白毒性的基因。优选地，步骤2)中酶切时内切酶识别的位点为步骤1)引入的酶切位点。优选地，步骤5)所述宿主菌为对ccdB蛋白毒性无抗性的细菌，更优选为对ccdB蛋白无抗性的大肠杆菌，如DH5α、Top10或Trans1-T1。优选地，步骤5)所述培养基为固体培养基。优选地所述培养基含有X-gal和IPTG，其中X-gal和IPTG的用量为本领域的常规用量。宿主菌的培养时间根据菌体性质决定。培养结束后分别计算其中蓝斑和白斑的数量，蓝斑和白斑的数量之和为总菌斑数量。所述错配率的计算方法为：(1-错配率)碱基数×循环数＝蓝斑数/总菌斑数将上式变形，最终可得：本专利技术的有益效果如下：与传统方法相比，本专利技术提供的一种将LacZα基因插入突变型ccdB基因的DNA聚合酶错配率检测方法，具有操作简单、快速且成本低的特点。附图说明下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细的说明。图1示出制备方法原理图图2示出pEASY-BluntZeroCloningVector质粒结构。图3示出缺失LacZα基因后的pEASY-BluntZeroCloningVector(记为Plasmid1)质粒结构。图4示出突变后的Plasmid1质粒结构。图5示出LacZα基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种DNA聚合酶错配率的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：1)制备含有突变型ccdB基因的质粒，其中所述突变型ccdB基因是通过同义突变在野生型ccdB基因内引入内切酶的酶切位点，所述酶切位点在所述质粒上是唯一的；2)内切酶酶切，获得线性化质粒；3)扩增LacZα基因；4)将步骤3)获得的LacZα基因连接到所述线性化质粒，获得连接产物；5)转化所述连接产物至宿主菌，并在培养基上进行培养；6)计算错配率。

【技术特征摘要】
1.一种DNA聚合酶错配率的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：1)制备含有突变型ccdB基因的质粒，其中所述突变型ccdB基因是通过同义突变在野生型ccdB基因内引入内切酶的酶切位点，所述酶切位点在所述质粒上是唯一的，所述质粒不表达抗ccdB蛋白毒性的基因；2)内切酶酶切步骤1)引入内切酶的酶切位点，获得线性化质粒；3)扩增LacZα基因；4)将步骤3)获得的LacZα基因连接到所述线性化质粒，获得连接产物；5)转化所述连接产物至宿主菌，并在培养基上进行培养；6)计算错配率。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述LacZα基因的DNA序列如序列表SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：耿亮，贺翠婷，辛文，马静，
申请(专利权)人：北京全式金生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11