本发明专利技术涉及猪圆环病毒2型基因工程亚单位口服疫苗的制备方法，包括以下步骤：1、序列合成；2、重组载体在大肠杆菌中的构建；3、重组载体在乳酸乳球菌MG1363中的构建；4、蛋白的表达，重组菌保存实验以及疫苗的制备。本发明专利技术具有以下有益效果：不需要对抗原进行特殊处理，避免了抗原纯化，减少抗原损失；优化基因序列，提高了抗原表达量；优化表达条件，解决了其他原核表达添加诱导剂对动物存在毒性问题以及高成本问题，并且避免了在表达过程中添加诱导剂增加污染几率和加大工作量；采用本发明专利技术的方法，成本低，效果显著；本发明专利技术采用口服疫苗，避免了常规注射疫苗所引起的应激及疫苗吸收问题。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物
，特别涉及猪圆环病毒2型基因工程亚单位口服疫苗 的制备方法。
技术介绍
猪圆环病毒2型（PCV2)不仅可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS)，而且也与 猪皮炎与肾病综合征（PDNS)、猪呼吸道疾病综合征（PRDC)、猪先天性振颤、母猪繁殖障碍、 猪增生性和坏死性肺炎等疾病密切相关。自从19世纪90年代发现可致猪的疾病以来，PCV2 病毒在世界各国迅速蔓延。目前PCV2在猪群中的感染率非常高，造成猪的生长缓慢，饲料 报酬下降，同时侵害猪的免疫系统，导致猪的免疫机能下降，造成其它疾病的大暴发。我国 也于2000年检测到了该病毒的存在，该病毒在我国猪群的感染率近乎50%。目前对于该病 毒的防制主要是依靠疫苗，而由于该病毒在细胞上增殖滴度很低，发展传统的灭活疫苗和 弱毒疫苗非常困难，因此，研制安全、高效、廉价的新型疫苗成为越来越多研宄者关注的焦 点，但目前的试验性疫苗诱发的免疫原性均不够理想，使得对于PCV2的新型疫苗的研宄进 展一直比较缓慢。 构建重组杆状病毒毒株rBac/PCV20RF2可在昆虫细胞中高效表达重组PCV2-0RF2 蛋白，所表达的重组0RF2蛋白具有良好的免疫活性和抗原性，可作为预防圆环病毒2型感 染引起的相关疫病用亚单位疫苗。但是该方法需要对蛋白进行纯化，然后加入灭活剂、防腐 剂等试剂乳化制苗并进行注射免疫，制备疫苗的过程繁琐，工艺复杂，作为常规注射疫苗， 容易引起应激及疫苗吸收问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术旨在提供猪圆环病毒2型基因工程亚单位口服疫苗的制备方 法，以解决上述提到的问题。 本专利技术提出了，包括以下步 骤： 步骤1、将猪圆环病毒2型0RF2基因进行优化改造，并且对所述0RF2基因序列进 行合成，得到PUC18-0RF2质粒； 步骤2、对所述pUC18-0RF2质粒在大肠杆菌中构建pMG36e- 0RF2质粒，并进行测 序分析； 步骤3、将所述pMG36e- 0RF2质粒在乳酸乳球菌MG1363中构建，得到乳酸乳球菌 MG1363/pMG36e-0RF2CCTCC2015156 ； 步骤4、所述乳酸乳球菌MG1363/pMG36e-0RF2CCTCC2015156接种到GM17液体 培养基中培养为菌液，28°C静置培养8-10h，将所述菌液按5%接种到GM17液体培养基中， 28°C静置培养约12_16h后尚心收集菌体，在所述静置培养期间每隔4_6h、180_220r/min振 荡培养IOmin;用灭菌PBS洗涤细胞1次，离心收集菌体，最后加入生理盐水与含一定比例 蔗糖和脱脂牛奶的混合液按1:1体积混合均匀，制备疫苗。 与现有技术相比，本专利技术提供的猪圆环病毒2型基因工程亚单位口服疫苗的制备 方法具有以下有益效果： 1、本专利技术不需要对抗原进 行特殊处理，避免了抗原纯化，减少抗原损失； 2、优化基因序列，提尚了抗原表达量； 3、优化蛋白表达条件，解决了其他原核表达添加诱导剂对动物存在毒性问题以及 高成本问题，并且避免了在表达过程中添加诱导剂增加污染几率和加大工作量； 4、采用本专利技术的方法，成本低，效果显著； 5、本专利技术采用口服疫苗，避免了常规注射疫苗所引起的应激及疫苗吸收问题。 为了上述以及相关的目的，一个或多个实施例包括后面将详细说明并在权利要求 中特别指出的特征。其它的益处和新颖性特征将随着下面的详细说明考虑而变得明显，所 公开的实施例是要包括所有这些方面以及它们的等同。 牛物材料保藏乳酸乳球菌MG1363/pMG36e-0RF2 LactococcuslactisMG1363/pMG36e_0RF2 保藏日期：2015年3月25日； 保藏编号：CCTCCNO:M2015156 ; 保藏单位：中国典型培养物保藏中心（CCTCC); 地址：中国.武汉.武汉大学【附图说明】 图1是本专利技术实施例SDS-PAGE鉴定结果的示意图； 图2是本专利技术实施例的Westernblot分析结果的示意图。图 1 中，M:Maker，1:乳酸乳球菌MG1363_pMG36e;2:乳酸乳球菌MG1363/ pMG36e-0RF2CCTCC2015156 ；图 2 中，M:Maker;1:乳酸乳球菌MG1363-pMG36e;2:乳酸乳球菌MG1363/ pMG36e-0RF2CCTCC2015156。【具体实施方式】 在以下详细描述中，提出大量特定细节，以便于提供对本专利技术的透彻理解。但是， 本领域的技术人员会理解，即使没有这些特定细节也可实施本专利技术。 下面参考附图和优选实施例，对本专利技术做详细描述。 在一些说明性实施例中，， 包括以下步骤： 步骤1、将猪圆环病毒2型0RF2基因进行优化改造，并且对所述0RF2基因序列进 行合成，得到PUC18-0RF2质粒； 步骤2、对所述pUC18-0RF2质粒在大肠杆菌中构建pMG36e-0RF2质粒，并进行测 序分析； 步骤3、将所述pMG36e- 0RF2质粒在乳酸乳球菌MG1363中构建，得到乳酸乳球菌 MG1363/pMG36e-0RF2CCTCC2015156 ； 步骤4、所述乳酸乳球菌MG1363/pMG36e-0RF2CCTCC2015156接种到GM17液体 培养基中培养为菌液，28°C静置培养8-10h，将所述菌液按5%接种到GM17液体培养基中， 28°C静置培养约12_16h后尚心收集菌体，在所述静置培养期间每隔4_6h、180_220r/min振 荡培养IOmin;用灭菌PBS洗涤细胞1次，离心收集菌体，最后悬浮于裂解缓冲液中进行超 声破碎，并对破碎产物进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图1所示，表明所表达的重组蛋白大 小约为30KDa;SDS-PAGE电泳结束后，将未染色的蛋白凝胶上的蛋白转移到PVDF膜上，用 1 %的BSA封闭，以兔抗PCV2血清为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG的二抗与之反应，最后用 DAB显色；WesternBlot鉴定结果如图2所示，表明重组蛋白具有与猪圆环病毒2型全病毒 制备的抗血清发生反应的能力，证明乳酸乳球菌MG1363/pMG36e-0RF2CCTCC2015156表达 的目的抗原具有了良好的反应原性；制备疫苗。 基因序列为：其中，本专利技术不需要对 抗原进行特殊处理，避免了抗原纯化，减少抗原损失；优化蛋白表达条件，将乳酸乳球菌 MG1363/pMG36e-0RF2CCTCC2015156 于GM17 培养基中 28°C静置培养约 12-16h，期间每隔 4-6h、180-220r/min振荡培养IOmin左右，即获得了外源基因正常高效表达，不需要加入诱 导剂，解决了其他原核表达添加诱导剂对动物存在毒性问题以及高成本问题，并且避免了 在表达过程中添加诱导剂增加污染几率和加大工作量。 在一些说明性实施例中，所述步骤1中，所述优化改造的方法为：将猪圆环病毒2 型0RF2基因序列中的稀有密码子替换为偏爱当前第1页1 2 3 本文档来自技高网...
【技术保护点】
猪圆环病毒2型基因工程亚单位口服疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、将猪圆环病毒2型ORF2基因进行优化改造，并且对ORF2基因序列进行合成，得到pUC18‑ORF2质粒；步骤2、对所述pUC18‑ORF2质粒在大肠杆菌中构建pMG36e–ORF2质粒，并进行测序分析；步骤3、将所述pMG36e–ORF2质粒在乳酸乳球菌MG1363中构建，得到乳酸乳球菌MG1363/pMG36e‑ORF2；步骤4、所述乳酸乳球菌MG1363/pMG36e‑ORF2接种到GM17液体培养基中培养为菌液，28℃静置培养8‑10h，将所述菌液按5％接种到GM17液体培养基中，28℃静置培养约12‑16h后离心收集菌体，在所述静置培养期间每隔4‑6h、180‑220r/min振荡培养10min；用灭菌PBS洗涤细胞1次，离心收集菌体，加入生理盐水与含一定比例蔗糖和脱脂牛奶的混合液按1：1体积混合均匀，制备疫苗。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李明义，卢金凤，刘阳，李晓林，赵航，葛栋，徐丽娜，李佳棋，李彦凤，
申请(专利权)人：山东信得科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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