本发明专利技术公开了一种从十大功劳叶中快速分离纯化单体化合物的方法，包括以下步骤：取阴干粉碎的十大功劳叶，加入乙醇溶液超声提取，过滤，滤液减压浓缩得十大功劳叶提取物；提取物经不同极性溶剂萃取后，乙酸乙酯萃取段用高速逆流色谱仪分离，根据色谱图收集相应峰组分，减压浓缩干燥，得到高纯度绿原酸、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷，克服了传统制备方法操作复杂，样品死吸附损失，收率低等缺点。本方法效率高，操作简单，制备量大，综合成本低，具有很好的推广使用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于天然药物化学领域，具体涉及一种从苦丁茶十大功劳叶中快速分离纯 化绿原酸、懈皮素_3_0_ β -D-匍萄糖苷、异鼠李素-3-〇- β -D-匍萄糖苷的方法。
技术介绍
十大功劳叶系小聚科植物阔叶十大功劳（#aAo/?ia Aea/ei (Fort. ) Carr.)的干 燥叶，具有清热解毒、消炎止痛、燥湿泻火、清肝明目之功效。在秦岭以南各省还被广泛应用 为苦丁茶。民间广泛用其作为主治头晕耳鸣、腰膝酸软、湿热泻痢、胃火牙痛、黄疸性肝炎等 疾病。现代药理研宄发现十大功劳具有抑菌、消炎、抗病毒、抗肿瘤、抗增殖及降血压等活 性，是一种有开发价值的药用植物。 对十大功劳化学成分的研宄多集中在其生物碱上，现未有文献报道从十大功劳 叶中分离出绿原酸、槲皮素-3-0-β-D-葡萄糖苷、异鼠李素-3-0-β-D-葡萄糖苷化合 物，现有文献报道从其它中草药中分离纯化绿原酸、槲皮素-3-0-β-D-葡萄糖苷、异鼠李 素-3-0-β-D-葡萄糖苷等的方法常采用柱层析方法。柴兴云等用95 %，90 %，85 %，70 %乙醇回流，乙酸乙酯萃取 及硅胶柱，SephadexLH - 20柱纯化分离的方法分离纯化，根据化合物的理化特征和光谱 数据鉴定其结构，从山银花中分离到绿原酸等化合物。槲皮素-3-0-β-D-葡萄糖苷、异鼠 李素-3-0-β -D-葡萄糖苷为分布在大部分高等植物植物中，万春鹏以70%乙醇室温提取，醋酸乙酯溶剂萃 取和大孔吸附树脂、SephadexLH-20, ODS及正相硅胶柱等色谱手段进行分离，分离出槲皮 素-3-0-β-D-葡萄糖苷。赵小亮等 利用硅胶柱、大孔吸附树脂柱、Sephadex LH-20柱和制备薄层色谱法等分离手段，经理化常 数和光谱分析从荷叶正丁醇部分中分离得到异鼠李素-3-0-β -D-葡萄糖苷。 这些成分通常采用反复的柱层析，操作复杂，耗时长，溶剂消耗量大，而且样品损 失大，重复效果不够理想。 高速逆流色谱（High-Speed Counter-Current Chromatography，HSCCC)是 Ito 等专利技术的一种新型的、连续高效的液-液分配色谱，是建立在一种特殊的动力学平衡现 象--单向性流体动力平衡（HDES)体系之上的一种分离方法。与常规固-液色谱分离方法 相比较，由于采用液体作为固定相载体，目标化合物在互不相容的两相由于分配系数的不 同而得以分离，解决了传统固体载体样品死吸附、变性、峰形拖尾等问题，用高速逆流色谱 法不仅使分离速度大为提高，且根据紫外吸收色谱图可良好重复收集样品，具有制备效率 高、制备量大、费用低等优点，因而近年来日益受到人们的关注，已经广泛应用于生物医药、 天然产物、环境分析、食品和化妆品等领域，特别在天然产物行业中已被认为是一种有效的 新型分离技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于：克服现有技术的不足，提供一种操作简便、综合成本低、 分离量大、产品纯度高、样品损失小的高效快速从十大功劳叶中分离纯化绿原酸、槲皮 素-3-〇- β -D-匍萄糖昔、异鼠李素-3-〇- β -D-匍萄糖昔的方法。 本专利技术的技术解决方案是：从十大功劳叶中分离纯化绿原酸、槲皮 素-3-〇-β -D-匍萄糖昔、异鼠李素-3-〇-β -D-匍萄糖昔的方法包括以下工艺步骤： (1)十大功劳叶提取物的制备：十大功劳叶阴干、粉碎，纯乙醇为溶剂超声提取，固液 比为1 :20，提取时间2 h，过滤，滤渣重复处理2次；合并滤液并真空减压浓缩得十大 功劳叶粗提物； ⑵将步骤1中粗提物用水打散，分别用正己烧，二氯甲烧，乙酸乙醋，正丁醇萃取，萃 取液过滤，减压浓缩分别得到正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取段，4° C冰箱 保存备用； (3)单体的分离：采用正己烷-甲醇-乙酸乙酯水为溶剂体系，上相为固定相，下相 为流动相，分离柱转速为700 - 900 rpm，对十大功劳叶乙酸乙酯萃取段进行HSCCC分离， 紫外检测器在线监测，分别收集不同馏分并减压干燥，得绿原酸、槲皮素-3-Ο-β-D-葡萄 糖苷、异鼠李素 _3_0_ β -D-匍萄糖苷。 步骤（3)所述的正己烷-甲醇-乙酸乙酯-水的体积比为1: 1:1:1-1:8:1:8,优选 I:5:1:5〇 步骤（3)所述的流动相流速为2 mL/min。 本专利技术的优点是：十大功劳叶提取物分离后各馏分经HPLC检测纯度可达85%以 上，各馏分进一步提纯可得到95%以上的纯品绿原酸、槲皮素-3-Ο-β-D-葡萄糖苷、异鼠 李素-3-0- β -D-葡萄糖苷，该方法适用于从十大功劳叶中一步纯化制备高纯度的绿原酸、 懈皮素_3_0_ β -D-匍萄糖苷、异鼠李素-3-〇- β -D-匍萄糖苷。稳定性好，操作简便。【附图说明】 图1是高速逆流色谱分离纯化十大功劳叶的色谱图； 图2是分离纯化得到的绿原酸的高效液相色谱图； 图3是分离纯化得到的槲皮素-3-0-β-D-葡萄糖苷的高效液相色谱图； 图4是分离纯化得到的异鼠李素-3-0-β-D-葡萄糖苷的高效液相色谱图。【具体实施方式】 取自然阴干的十大功劳叶5.0 kg，粉碎，纯乙醇为溶剂超声提取，固液比为1 :20 ，提取时间2 h，过滤，滤渣重复处理2次；合并滤液并真空减压浓缩得十大功劳叶粗提 物；粗提物用水打散，分别用正己烧，二氯甲烧，乙酸乙醋，正丁醇萃取，萃取液过滤，减压浓 缩分别得到正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取段，4° C冰箱保存备用。采用体 积比1:5:1:5的正己烷-甲醇-乙酸乙酯水为溶剂体系，流动相（下相）流速为2 mL/ min，分离柱转速为900 rpm，上相为固定相，对十大功劳叶乙酸乙醋萃取段进行HSCCC分 离，紫外检测器在线监测，检测波长为254 nm，收集目标成分，馏分经减压浓缩干燥，得到 相应高纯度化合物，如图1所示。 经1H-NMR、13C-NMR鉴定化学结构如下，即所得单体化合物分别为绿原酸18. 32mg、槲皮素-3-0-β -D-葡萄糖苷20. 46 mg、异 鼠李素-3-0- β -D-葡萄糖苷28. 36 mg，以色谱峰面积归一化法计算，纯度均高于97%，如图 2-图4所示。【主权项】1. ，其特征在于，包括以下工 艺步骤： (1) 十大功劳叶提取物的制备：十大功劳叶阴干、粉碎，纯乙醇为溶剂超声提取，固液 比为1 :20,提取时间2h，过滤，滤渣重复处理2次；合并滤液并真空减压浓缩得十大功劳 叶粗提物； (2) 将步骤（1)中粗提物用水打散，分别用正己烷，二氯甲烷，乙酸乙酯，正丁醇萃取， 萃取液过滤，减压浓缩分别得到正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取段，4°C冰 箱保存备用； ⑶单体的分离：采用正己烷-甲醇-乙酸乙酯-水为溶剂体系，上相为固定相，下相 为流动相，分离柱转速为700 - 900rpm，对十大功劳叶乙酸乙酯萃取段进行HSCCC分离， 紫外检测器在线监测，分别收集不同馏分并减压干燥，得绿原酸、槲皮素-3-0-0-D-葡萄 糖苷、异鼠李素_3_0_ 0 -D-匍萄糖苷。2. 根据权利要求1所述的，其 特征在于，步骤（3)所述的正己烷-甲醇-乙酸乙酯-水的体积比为I:I:I:I- 1:8:1: 8。3. 本文档来自技高网...
【技术保护点】
高速逆流色谱分离纯化十大功劳叶中单体化合物的方法，其特征在于，包括以下工艺步骤：(1) 十大功劳叶提取物的制备：十大功劳叶阴干、粉碎，纯乙醇为溶剂超声提取，固液比为 1 ：20，提取时间 2 h，过滤，滤渣重复处理2次；合并滤液并真空减压浓缩得十大功劳叶粗提物；(2) 将步骤（1）中粗提物用水打散，分别用正己烷，二氯甲烷，乙酸乙酯，正丁醇萃取，萃取液过滤，减压浓缩分别得到正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取段，4°C冰箱保存备用；(3) 单体的分离：采用正己烷‑甲醇‑乙酸乙酯‑水为溶剂体系，上相为固定相，下相为流动相，分离柱转速为700 ‑ 900 rpm，对十大功劳叶乙酸乙酯萃取段进行 HSCCC 分离，紫外检测器在线监测，分别收集不同馏分并减压干燥，得绿原酸、槲皮素‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖苷、异鼠李素‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖苷。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：胡卫成，王新风，沈婷，吴磊，
申请(专利权)人：淮阴师范学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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