一种异烟棒曲霉素C的制备方法技术

一种异烟棒曲霉素C的制备方法，步骤：1）复苏固体培养基的配制；2）液体发酵培养基的配制；3）菌种复苏；4）发酵培养；5）过滤、萃取；6）粗制；7）精制，即得异烟棒曲霉素C。其优点是：1、本发明专利技术的培养基(复苏固体培养基、液体发酵培养基的配制)简单易得、成本低；真菌生长速度快、孢子活力高；提高了工作效率；2、污染小、效率高、产率高、纯度高，可操作性强。具体为：采用二氯甲烷取代氯仿，洗脱剂毒性减小；粗制仅需三种体系洗脱剂，步骤大大简化，精制采用恒梯度以甲醇-水洗脱，操作简单，减少了样品损失，提高了制备效率；产率提高了约5倍，即由6.8μg/mL提高到33μg/mL；结合高效液相色谱制备，目标产物的纯度高达99.3%。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物碱类化合物的制备
，具体涉及一种异烟棒曲霉素 C的制 备方法。
技术介绍
据世界卫生组织（WTO)估计，每天约5万人死于感染性疾病。革兰阳性菌（如葡 萄球菌和链球菌）是引起人类感染甚至导致死亡的主要致病菌。其中葡萄球菌可引起轻度 皮肤脓疱症、呼吸道感染和脓毒症等多种疾病，严重者可导致死亡。肺炎链球菌主要引起 急性呼吸道感染，如中耳炎、咽炎、鼻窦炎和肺炎等。此外，肺炎链球菌和其他链球菌也 可引起皮肤感染、脑膜炎和脓毒症，这些感染性疾病给人类带来了极大的痛苦。目前针对 革兰氏阳性菌感染的药物主要为抗生素类药物，如青霉素、头孢类、红霉素、喹诺酮类等药 物。近年来致病菌的多重耐药性已严重影响抗菌药的临床疗效，革兰氏阳性菌耐药性问题 尤为突出，以葡萄球菌、链球菌和肠球菌的耐药性最为常见和严重。如何克服抗生素耐药 性，成为人们关注和研宄的热点之一。如何更有效地解决这个问题，当务之急就是寻找并 开发新型有效的抗菌药。本专利技术旨在提供一种具有抗革兰氏阳性菌活性的异烟棒曲霉素 C (Roquefortine C)，其结构如式如下：它是一种具有较强的革兰氏阳性菌抑制活性的生物碱类化合物，可作为革兰氏阳性菌 抑制剂用于由革兰氏阳性菌感染所导致的疾病的治疗，还可作为抑制革兰氏阳性菌的低分 子生物探针，用于生命科学研宄，为进一步研发新型抗菌药提供了备选药物。本专利技术从印度 洋深海沉积物来源的青霉菌Penicillium sp. Y32中，分离得到了异烟棒曲霉素 C，通过反 复实验、探索，得到了规模化生产异烟棒曲霉素 C较佳的方法。【专利技术内容】 本专利技术要解决的技术问题是：克服现有技术的不足，提供一种操作方便、产率高、 产品纯度高的异烟棒曲霉素 C的制备方法。 本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种异烟棒曲霉素 C的制备方法， 其特征在于：包括如下步骤： 1)复苏固体培养基的配制：每升水中下列各组分按重量百分比为：麦芽浸膏 I. 5~1. 8%、大豆蛋白胨0. 15~0. 35%、琼脂I. 8~2. 3%，该培养基的初始pH值为5. 5~6. 0 ;在 生物安全柜中，将经过灭菌后的复苏培养基在温度大于40°C时，倒入经过灭菌的培养皿中， 自然冷却备用； 2) 液体发酵培养基的配制：每升水中下列各组分按重量百分比为：麦芽浸膏 I. 5~1. 8%、大豆蛋白胨0. 15~0. 35%，该培养基的初始pH值为5. 5~6. 0 ;将该培养基倒入烧 瓶中，封口、灭菌备用； 3) 菌种复苏：取一定量的青霉菌Penicillium sp.Y32,将其接种到步骤1所述的复苏 固体培养基上，放入25 °C~30 °C恒温培养箱中，培养一至两天； 4) 发酵培养：在生物安全柜中，将步骤3中在复苏固体培养基上培养出的菌种孢子，接 种到步骤2所述的含有液体培养基的烧瓶中，在温度为25°C~30°C恒温静置培养25-35 天； 5) 过滤、萃取：将步骤4所得的菌液与菌丝体进行过滤、分离； 取菌液，用1~2倍体积的乙酸乙酯，超声萃取三次； 取菌丝体，先用80%丙酮水溶液浸泡2~4小时，超声、机械破碎，过滤后的混合液蒸发 掉丙酮后，采用1~2倍体积的乙酸乙酯超声萃取三次； 合并两者的乙酸乙酯萃取物； 6) 粗制：将步骤5所得的乙酸乙酯萃取物进行浓缩，与100-300目的硅胶拌样；将拌样 硅胶加到3倍体积的300-400目的硅胶柱层析上，依次使用二氯甲烷、60:1的二氯甲烷-甲 醇、30:1的二氯甲烷-甲醇三种溶剂进行系统洗脱；将使用30:1的二氯甲烷-甲醇所得的 洗脱液进行收集，并浓缩至固态，得到粗品； 7) 精制：将上述粗品使用甲醇进行溶解、用滤膜过滤，滤液加载于高效液相色谱仪以一 定的流速，进行分离纯化，洗脱溶剂使用80:20的甲醇-水，从而得到异烟棒曲霉素 C。 优选的，步骤2)中，所述复苏固体培养基中，上述麦芽浸膏1.6%、大豆蛋白胨 0. 2%、琼脂 2%。 优选的，步骤2)中，所述液体发酵培养基中，上述麦芽浸膏1.6%、大豆蛋白胨 0. 2%〇 优选的，步骤6)中，所述拌样硅胶为200目。 优选的，步骤7)中，所述高效液相色谱的流速为2~3 mL/min。 优选的，步骤7)中，所述滤膜为0. 45mm。 与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：1、本专利技术的培养基简单易得、成本低，青 霉菌Penicillium sp. Y32复苏所需的时间仅需一、二天，比传统培养基的复苏时间至少 缩短两天；配合较高的培养温度（28°C)，真菌生长速度快、孢子活力高；在发酵培养中，选 用直接接种到液体培养基中，相比传统的种子液培养，传代的时间极大缩短，提高了工作效 率；本专利技术提供的发酵方法，简单易行。2、本专利技术相比文献报道的普通分离方法，污染小、 效率高、产率高、纯度高，可操作性强。具体为：（1)采用二氯甲烷取代氯仿，洗脱剂毒性减 小。（2)粗制仅需二种体系洗脱剂，步骤大大简化，精制米用恒梯度以甲醇-水（80 :20)洗 脱，促使操作简单，减少由于步骤繁琐造成的样品损失，提高了制备效率。（3)结合高效发 酵培养与简易分离步骤，比现有技术的产率提高了约5倍，即由6.8 yg/mL提高到33 yg/ mL。（4)结合高效液相色谱制备，目标产物的纯度高达99. 3%。【具体实施方式】 下面结合实施例，对本专利技术做进一步描述： 实施例一 按照水：麦芽浸膏：大豆蛋白胨：琼脂=100 :1. 6 :0. 2 :2的重量百分比，配制复苏固体 培养基，使得其pH值为5. 5;将一定量的青霉菌Penicillium sp. Y32接种到上述复苏 固体培养基上，在28°C培养箱中恒温培养2天；按照水：麦芽浸膏：大豆蛋白胨=100 :1. 6 : 〇. 2的重量百分比，配制液体培养液，使得其pH值为5. 5 ;取复苏固体培养基上的青霉菌 Penicillium sp. Y32适量，将其接种到装有上述液体培养液的三角瓶中，进行为期30天的 恒温28 °C的静置培养。 30天后，经过过滤，先将与菌丝体相分离的发酵液亦即菌液，采用等体积的乙酸乙 酯将发酵液萃取三次，合并萃取液，获得发酵液的乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至固态； 再将菌丝体先用80%丙酮水溶液浸泡4小时、机械破碎、水浴超声提取60分钟；经三次 提取后，合并三次所得的菌丝体提取液；将该菌丝体提取液减压浓缩至不含丙酮，得到的菌 丝体提取物，使用等体积的乙酸乙酯萃取三次，得到菌丝体提取物的乙酸乙酯萃取液；再将 当前第1页1 2 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种异烟棒曲霉素C的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：1）复苏固体培养基的配制：每升水中下列各组分按重量百分比为：麦芽浸膏1.5~1.8%、大豆蛋白胨0.15~0.35%、琼脂 1.8~2.3%，该培养基的初始pH值为5.5～6.0；在生物安全柜中，将经过灭菌后的复苏培养基在温度大于40℃时，倒入经过灭菌的培养皿中，自然冷却备用；2）液体发酵培养基的配制：每升水中下列各组分按重量百分比为：麦芽浸膏1.5~1.8%、大豆蛋白胨0.15~0.35%，该培养基的初始pH值为5.5～6.0；将该培养基倒入烧瓶中，封口、灭菌备用；3）菌种复苏: 取一定量的青霉菌Penicillium sp.Y32，将其接种到步骤1所述的复苏固体培养基上，放入25℃～30℃恒温培养箱中，培养一至两天；4）发酵培养：在生物安全柜中，将步骤3中在复苏固体培养基上培养出的菌种孢子，接种到步骤2 所述的含有液体培养基的烧瓶中，在温度为25℃～30℃恒温静置培养25‑35天；5）过滤、萃取：将步骤4所得的菌液与菌丝体进行过滤、分离；取菌液，用1~2倍体积的乙酸乙酯，超声萃取三次；取菌丝体，先用80%丙酮水溶液浸泡2～4小时，超声、机械破碎，过滤后的混合液蒸发掉丙酮后，采用1~2倍体积的乙酸乙酯超声萃取三次；合并两者的乙酸乙酯萃取物；6）粗制：将步骤5所得的乙酸乙酯萃取物进行浓缩，与100‑300目的硅胶拌样；将拌样硅胶加到3倍体积的300‑400目的硅胶柱层析上，依次使用二氯甲烷、60:1的二氯甲烷‑甲醇、30:1的二氯甲烷‑甲醇三种溶剂进行系统洗脱；将使用30:1的二氯甲烷‑甲醇所得的洗脱液进行收集，并浓缩至固态，得到粗品；7）精制：将上述粗品使用甲醇进行溶解、用滤膜过滤，滤液加载于高效液相色谱仪以一定的流速，进行分离纯化，洗脱溶剂使用80:20的甲醇‑水，从而得到异烟棒曲霉素C。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈颢，樊亚琴，杜宁，李培海，
申请(专利权)人：国家海洋局第一海洋研究所，中国大洋矿产资源研究开发协会，
类型：发明
国别省市：山东;37