检测动物源食品中残留药物的方法及液质数据库技术

本发明专利技术涉及一种用于检测动物源食品中残留药物的液质数据库及其使用方法，该数据库的制备包括如下步骤：(1)标准工作溶液的制备；(2)分析前处理，采用快速酶解+快速固相萃取(SPE)的提取净化技术进行待测样本分析前处理工作；(3)一次性进样色谱分析；(4)构建液质谱库。

【技术实现步骤摘要】
检测动物源食品中残留药物的方法及液质数据库
本专利技术属于生物检测领域，具体而言，涉及一种用于检测动物源食品中残留药物的液质数据库及其使用方法。
技术介绍
动物源食品在国际农产品贸易中占相当比重，针对动物源食品中药物残留的法规限制越来越严格，以日本06年5月实施的“肯定列表”制度为例，其对236种兽药和饲料添加剂制定了具体限量标准，而在国内食品安全领域，从早期的“氯霉素、硝基呋喃”到后来的“孔雀石绿、瘦肉精”，因药物残留导致的食品安全事件频发凸显我国食品安全监管控制体系技术支撑能力不足，迫切需要建立多种类残留快速筛选方法。目前，针对动物源食品中药物残留检测技术和方法已由单残留分析发展到了单种类多残留分析，03年以来，以物质种类界分的多残留检测标准占据了残留分析国家和行业标准的70％以上。同时期，质谱分析已经成为多残留检测的主要技术手段，以欧盟2002/657/EC法规为蓝本的技术指标规则也为国际上所承认和接受。随着残留分析技术的发展，多种类残留分析在信息量、检测效率等多方面具有优势使其成为研发热点，且质谱设备领域如Q-TOF，Q-Trap等串联质谱仪的实用化，以高级质谱技术为基础的谱库比对分析逐渐成熟也为多种类残留快速分析提供了技术可能。然而，无论是在方法开发、验证和标准化还是在法规完善等方面，同时检测多种类残留都存在较多困难：(1)不同种类兽药物化性质差别很大，极性覆盖范围宽，在不同基质中残留形态不一，个别兽药尚需衍生化方能有效检测，因此在通用前处理方法和色谱一次进样分析上难以实现有效突破；(2)法规对不同兽药(禁用药物和限用药物)的限量要求和使用规定不一，多种类残留检测验证规则尚未完善；(3)方法开发需要的空白基质难以获得，混合标准溶液制备困难；(4)仪器的分析能力。在构建液质谱库方面，尽管有商业化谱库如AB公司法医毒物数据库(1250种目标分析物)、兽药数据库(139种目标分析物)；Freiburg大学医院的小分子药物数据库等，但存在如下应用局限：1)仅有MS/MS数据，无色谱体系信息特征；2)无在线信息特征；3)无统一前处理方法和仪器分析相偶联；4)缺乏基质标准数据。因此，在现有条件下，很难有效实现基于液质谱库技术的多种类残留快速筛查分析。
技术实现思路
鉴于目前国内外在动物源食品多种类残留药物分析中存在的样品通用性前处理、仪器快速分析和筛选方法验证等技术难点。本专利技术以建立动物源食品中高风险药物多种类残留快速筛选检测体系为目的，通过采用多溶剂体系分段组合提取、建立样品高通量通用性前处理技术、综合优化色谱体系实现多目标分析物宽极性范围液相色谱有效保留与分离、并通过构建涵盖色谱-质谱多维信息的液相色谱-质谱/质谱数据库及依据法规要求和检测实践进行筛选方法验证等关键
技术实现思路
的研发，突破多种类残留分析技术难关，建立一个以多种类残留通用性前处理技术、快速分离体系和液质谱库为技术特征的开放性快速分析平台和有效筛查检测技术体系。本专利技术针对12种限量值在1.0μg/kg以下高风险残留药物(A类残留物质)作为检测目标，该组药物分别为，(1)甾体激素类化合物：睾酮(T)、泼尼松龙(PNSL)、倍他米松(BTS)、地塞米松(DTS)；(2)硝基咪唑类药物及其代谢产物：甲硝哒唑(MNZ)、咯硝哒唑(RNZ)、二甲硝咪唑(DMZ)；(3)Beta-受体激动剂类物质：克伦特罗(CLB)、妥布特罗(TUL)、西马特罗(CIM)；(4)染料类物质：结晶紫(CV)和隐色结晶紫(LCV)；本专利技术首先涉及一种检测动物源食品中高风险药物多种类残留的快速筛选液质谱库的构建方法，所述的动物源食品为禽蛋类食品或蜂蜜类食品，具体包括如下步骤，(1)标准工作溶液的制备；甾体激素类化合物、硝基咪唑类药物及其代谢产物、Beta-受体激动剂类物质：采用乙腈分类配制其混合标准储备溶液(0.01g/L)；染料类等物质采用甲醇分类配制其混合标准储备溶液(0.01g/L)；混合和标准工作溶液(0.1mg/L)，分别移取睾酮、泼尼松龙、倍他米松、地塞米松、甲硝唑、咯硝哒唑、二甲硝咪唑、克伦特罗、妥布特罗、西马特罗、结晶紫和隐色结晶紫标准储备溶液适量，用乙腈配制浓度为0.1mg/L的混合标准溶液；(2)分析前处理，采用快速酶解(释放结合态残留)+快速固相萃取(SPE)的提取净化技术进行待测样本分析前处理工作，具体的提取净化过程如下：1)提取：称取均质样品5g，置于50mL聚四氟乙烯离心管中，加入乙酸铵缓冲液(0.2mol/L,pH5.2)15mL，β-葡糖苷酸/硫酸酯酶50μL，涡旋混匀，50℃水浴振荡2h，放冷至室温，于0℃，15000rpm离心5min，转移上清至另一干净离心管中，用NaOH溶液(5mol/L)调节pH至9.0，再加入乙酸乙酯20mL,氯化钠6g，振荡涡旋5min，于0℃，15000rpm离心5min，取上层有机相35℃旋蒸至近干，氮气吹干，残渣使用5mL0.1mol/L盐酸溶液溶解，超声1min，留待上柱净化；2)净化：MCX柱(WatersOasisMCXSPE小柱)安装于固相萃取装置上(该装置在技术专利CN201020014620.X中有详细记载)，依次使用甲醇3mL，水3mL，3mL0.1mol/L盐酸溶液活化。将提取溶液加载在固相萃取柱上，在重力作用下流出，依次使用3mL水，3mL甲醇和5mL正己烷淋洗小柱，抽干2min，加入6mL洗脱液(乙酸乙酯50mL，甲醇45mL，氨水5mL，混匀)洗脱。洗脱液35℃下氮气流吹干，使用样品溶解液(量取0.1％甲酸乙腈(V/V)溶液5mL，与甲酸铵(5mmol/L)-甲酸(0.1％)-水溶液95mL混匀)0.5mL溶解残渣，超声1min，过0.22μM微孔滤膜；所述的固相萃取装置整合试剂架、氮吹仪的功能且操作压力相对均匀，其由试剂架、操作台、8个玻璃仓、8个梨形瓶和1个自动吸气装置组成，可实现目标分析物的快速SPE过程。(3)一次性进样色谱分析使用色谱柱为KinetexC18柱，采用乙腈为有机相，甲酸作为离子化增强剂，甲酸盐作为峰形优化剂，以水相/酸性乙腈的组合作为优化的流动相体系；具体条件为：色谱柱：KinetexC18,2.6μm，2.1mm×100mmi.d.；流速：0.2mL/min；进样量：10μL；柱温：30℃；梯度洗脱程序：(A：0.1％甲酸-乙腈溶液；B：甲酸铵(5mmol/L)-甲酸(0.1％)-水溶液)0～2min：5％A；～8min：20％A；～15min：95％A；～16min：100％A；～19min：100％A；20min：5％A；(4)构建液质谱库采用四级杆/离子阱串联质谱的高级采集模式：预设定多反应检测(sMRM)-信息依赖性采集(IDA)-增强子离子扫描(EPI)；质谱参数确定过程如下：使用初始流动相按目标分析物类别稀释混标储备溶液至浓度为0.2mg/L，然后使用恒流注射泵以5μL/min的流速注入质谱离子源中进行参数优化，分别使用Q1MS、Q1MultipleIons、ProductIon、MRM等扫描模式确定目标分析物的母离子，子离子，并使用Ramp功能优化并确定解聚电压(DP)、碰撞室入口电压(EP)、碰撞能量(CE)、碰撞室出口电压(CXP)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测动物源食品中高风险药物多种类残留的快速筛选液质谱库的构建方法，具体包括如下步骤，(1)标准工作溶液的制备；(2)分析前处理，采用快速酶解释放结合态残留+快速固相萃取(SPE)的提取净化技术进行待测样本分析前处理工作；(3)一次性进样色谱分析；(4)构建液质谱库；所述的动物源食品为禽蛋类食品或蜂蜜类食品，所述的高风险药物为限量值在1.0μg/kg以下高风险残留药物，具体为：(a)甾体激素类化合物：睾酮(T)、泼尼松龙(PNSL)、倍他米松(BTS)、地塞米松(DTS)；(b)硝基咪唑类药物及其代谢产物：甲硝哒唑(MNZ)、咯硝哒唑(RNZ)、二甲硝咪唑(DMZ)；(c)Beta‑受体激动剂类物质：克伦特罗(CLB)、妥布特罗(TUL)、西马特罗(CIM)；(d)染料类物质：结晶紫(CV)和隐色结晶紫(LCV)。

【技术特征摘要】
1.一种检测动物源食品中高风险药物多种类残留的快速筛选液质谱库的构建方法，具体包括如下步骤，(1)标准工作溶液的制备；(2)分析前处理，采用快速酶解释放结合态残留+快速固相萃取的提取净化技术进行待测样本分析前处理工作；(3)一次性进样色谱分析；(4)构建液质谱库；所述的动物源食品为禽蛋类食品或蜂蜜类食品，所述的高风险药物为限量值在1.0μg/kg以下高风险残留药物，具体为：(a)甾体激素类化合物：睾酮、泼尼松龙、倍他米松、地塞米松；(b)硝基咪唑类药物及其代谢产物：甲硝哒唑、咯硝哒唑、二甲硝咪唑；(c)Beta-受体激动剂类物质：克伦特罗、妥布特罗、西马特罗；(d)染料类物质：结晶紫和隐色结晶紫；步骤(1)所述的标准工作液的制备方法为：甾体激素类化合物、硝基咪唑类药物及其代谢产物、Beta-受体激动剂类物质：采用乙腈分类配制浓度为0.01g/L的混合标准储备溶液；染料类物质采用甲醇分类配制浓度为0.01g/L的混合标准储备溶液；浓度为0.1mg/L混合标准工作溶液，分别移取睾酮、泼尼松龙、倍他米松、地塞米松、甲硝唑、咯硝哒唑、二甲硝咪唑、克伦特罗、妥布特罗、西马特罗、结晶紫和隐色结晶紫标准储备溶液适量，用乙腈配制浓度为0.1mg/L的混合标准溶液；步骤(2)所述的分析前处理方法如下，1)提取：称取均质样品5g，置于50mL聚四氟乙烯离心管中，加入浓度为0.2mol/L，pH5.2的乙酸铵缓冲液15mL，β-葡糖苷酸/硫酸酯酶50μL，涡旋混匀，50℃水浴振荡2h，放冷至室温，于0℃，15000rpm离心5min，转移上清至另一干净离心管中，用5mol/L的NaOH溶液调节pH至9.0，再加入乙酸乙酯20mL,氯化钠6g，振荡涡旋5min，于0℃，15000rpm离心5min，取上层有机相35℃旋蒸至近干，氮气吹干，残渣使用5mL0.1mol/L盐酸溶液溶解，超声1min，留待上柱净化；2)净化：MCX柱安装于固相萃取装置上，依次使用甲醇3mL，水3mL，3mL0.1mol/L盐酸溶液活化；将提取溶液加载在固相萃取柱上，在重力作用下流出，依次使用3mL水，3mL甲醇和5mL正己烷淋洗小柱，抽干2min，加入6mL洗脱液洗脱，洗脱液35℃下氮气流吹干，使用样品溶解液0.5mL溶解残渣，超声1min，过0.22μm微孔滤膜；所述的固相萃取装置整合试剂架、氮吹仪的功能，且操作压力相对均匀，其由试剂架、操作台、5～10个玻璃仓、5～10个梨形瓶和1～2个自动吸气装置组成，实现目标分析物的快速SPE过程；所述的步骤(2)的1)提取步骤中，如样品为蛋类样品，则加入适量硅藻土；所述的步骤(2)的2)净化步骤中，洗脱液的配置方法为：乙酸乙酯50mL，甲醇45mL，氨水5mL，混匀；样品溶解液的配置方法为：量取体积比0.1％甲酸乙腈溶液5mL，与5mmol/L的甲酸铵-0.1％的甲酸-水溶液95mL混匀；所述步骤(3)中所述的一次性进样色谱分析方法如下，使用色谱柱为KinetexC18柱，采用乙腈为有机相，甲酸作为离子化增强剂，甲酸盐作为峰形优化剂，以水相/酸性乙腈的组合作为优化的流动相体系；具体条件为：色谱柱：KinetexC18,2.6μm，2.1mm×100mmi.d.；流速：0.2mL/min；进样量：10μL；柱温：30℃；梯度洗脱程序如下：时间流动相成分0～2min，5％A，其余为B...

【专利技术属性】
技术研发人员：张鸿伟，张晓梅，梁成珠，
申请(专利权)人：山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：山东;37