本发明专利技术的课题在于，提供一种在以家蚕为代表的绢丝虫的后部绢丝腺中可以大量地表达重组肽、特别是水溶性肽的后部绢丝腺基因表达单元；及该基因表达单元被转入其中的转基因绢丝虫。提供一种后部绢丝腺基因表达单元，其包含：编码在后部绢丝腺中特异性地表达的蛋白质的基因的启动子、与该启动子的下游功能性地连接的编码来自在中部绢丝腺中特异性地表达的蛋白质的信号肽的DNA、及连接于其下游的编码不含有分泌作为丝心蛋白的构成成分的蛋白质的目标肽的DNA。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】后部绢丝腺基因表达单元及具有其的转基因绢丝虫
本专利技术涉及一种可以在绢丝虫诸如家蚕的后部绢丝腺中大量地表达目标肽的后部绢丝腺基因表达单元及具有其的转基因绢丝虫。
技术介绍
家蚕(Bombyxmori)的绢丝腺具有可以在短期间内合成大量蛋白质的能力。另外，由于家蚕的绢丝腺为大型器官，因此容易摘除，另外还具有如下优点：由于所合成的蛋白质被贮藏在绢丝腺内腔，所以容易回收。因此，在绢丝腺中表达目标蛋白质的转基因蚕具有作为蛋白质的大量生产系统的前景。家蚕的绢丝腺在形态学上为图1所示的左右1对器官，分别由前部绢丝腺、中部绢丝腺及后部绢丝腺这3个区域构成。在后部绢丝腺细胞内，构成作为绢丝的纤维成分的丝心蛋白的3种主要的蛋白质，丝心蛋白H链(以下，经常简称为“FibH”)、丝心蛋白L链(以下，经常简称为“FibL”)、及p25/FHX(以下，称为“p25”)进行表达。另外，在中部绢丝腺细胞内，作为绢丝的包覆成分的明胶样蛋白质，丝胶蛋白进行表达(图1)。在后部绢丝腺细胞内表达的上述3种蛋白质以FibH：FibL：p25＝6：6：1的比率形成复合体(silkfibroinelementaryunit；本说明书中，以下称为“SFEU复合体”。)，在后部绢丝腺内腔中被分泌。与此相对，丝胶蛋白在表达后在中部绢丝腺内腔中被分泌。在后部绢丝腺内腔中被分泌的丝心蛋白其后转移至中部绢丝腺内腔，用丝胶蛋白包覆而作为绢丝吐丝(图1：非专利文献1)。因此，将家蚕绢丝腺作为蛋白质表达系统利用的情况下，利用在中部绢丝腺或后部绢丝腺中特异性地表达的基因表达系统即可。将家蚕绢丝腺作为蛋白质表达系统利用的情况下，迄今为止，确立了作为使用中部绢丝腺的重组蛋白质表达系统的GAL4/UAS系统(非专利文献2)、或利用组合丝胶蛋白1启动子及Hr3增强子的系统的大量表达方法(非专利文献3)。另一方面，已知后部绢丝腺中的蛋白质合成能力为中部绢丝腺的蛋白质合成能力的约3倍(非专利文献4)。因此，如果从生产方面判断，与中部绢丝腺相比，后部绢丝腺作为蛋白质表达系统是更优选的。另外，在后部绢丝腺中所生产的重组蛋白质与茧丝同时分泌，因此还适于作为绢纤维利用(非专利文献5)。但是，由迄今为止的研究得知：虽然其它丝心蛋白的构成蛋白质正常地表达，但在FibH中存在异常的家蚕的突变品系(Nd品系)和在FibL中存在异常的家蚕的突变品系(Nd-s品系及Nd-sD品系)几乎不能吐丝(非专利文献6)。另外，由上述突变品系的分析表明：在向后部绢丝腺内腔的FibH、FibL、和/或p25的有效的分泌中，上述SFEU复合体的形成是重要的(非专利文献7及8)。因此，上述突变品系不能吐丝的原因被认为是：由于在任一种构成蛋白质中存在异常，因此不能形成SFEU复合体，导致FibH、FibL及p25均不能从后部绢丝腺细胞向内腔中分泌(非专利文献9)。根据这种观点，在后部绢丝腺细胞内表达的蛋白质在构成SFEU复合体时仅有效地分泌到细胞外，这是该领域的一般说法。因此，若要将后部绢丝腺作为蛋白质表达系统利用，必须想办法使目标重组蛋白质作为SFEU复合体的一部分表达等，以在后部绢丝腺中利用特异性分泌系统。作为使重组蛋白质在后部绢丝腺中作为SFEU复合体的一部分表达、分泌的具体方法，已知有作为在FibH基因或FibL基因的启动子的下游将FibH或FibL的全部或一部分和重组蛋白质融合的融合蛋白质(嵌合蛋白质)表达的方法(图2a及b)(非专利文献10、11)。由于这种嵌合蛋白质作为SFEU复合体的一部分被插入，因此向后部绢丝腺的内腔的分泌会有效地进行。但是，由于插入于SFEU复合体会成为不溶性的，因此为了回收重组蛋白质，必须进行分泌的SFEU复合体的可溶性化处理。可溶性化中必须利用强的改性剂进行处理，进而，为了使生理活性地表达，有时也需要将嵌合蛋白质中的丝心蛋白的构成蛋白质部分裂解。因此，在后部绢丝腺中表达的重组蛋白质不仅回收困难，而且还存在伴有失去其活性的风险的重大问题。另一方面，还已知不将重组蛋白质作为不溶性SFEU复合体的构成成分，而作为水溶性蛋白质在后部绢丝腺中表达、分泌的方法。可列举例如在编码目标重组蛋白质的DNA的上游附加编码p25的信号肽的DNA的方法(图2c)(非专利文献12)。该方法中，目标蛋白质可作为水溶性蛋白质表达，但存在表达量及分泌效率低的重大问题(非专利文献12)。另外，还尝试不使用后部绢丝腺特异性的蛋白质的信号肽，而如专利文献1中记载的台湾兜虫的防御素的表达方法那样，以含有目标重组蛋白质自身的信号肽的状态使该重组蛋白质在后部绢丝腺中以可溶性化的状态表达的方法。但是，该方法也与上述方法一样，存在虽然作为目标蛋白质可表达、但是表达量及分泌效率低的问题。根据以上的理由，在该领域中，认为后部绢丝腺在使用转基因蚕的绢丝腺表达系统、以水溶性的状态简单且大量地生产蛋白质的情况下是不适合的。现有技术文献专利文献专利文献1日本特开2005-95063非专利文献非专利文献1InoueS.etal.，2000,TheJournalofBiologicalChemistry，275(51)：40517-40528.非专利文献2TatematsuK.etal.，2010,TransgenicResearch，19(3)：473-87.非专利文献3TomitaM.etal.，2007，TransgenicResearch，16(4)：449-465.非专利文献4M.Mondaletal.，2007，CaspianJ.Env.Sci5(2)：63-7.非专利文献5田村俊樹他，2008，農農技術，63卷第7号：320-236.非专利文献6GamoT.etal.，1985，J.seric.Sci.Jpn，54，412-419.非专利文献7TakeiF.etal.，1984，TheJournalofCellBiology，99：2005-2010.非专利文献8TakeiF.etal.，1987，TheJournalofCellBiology，105：175-180.非专利文献9InoueS.etal.，2004，Eur.J.Biochem.271：356-366.非专利文献10KojimaK.etal.，2007，BiosciBiotechnolBiochem，71：2943-2951.非专利文献11TomitaM.etal.，2003，NatBiotechnol，21：52-56.非专利文献12RoyerC.etal.，2005，TransgenicRes，14：463-472.专利技术概述然而，如果重组肽不作为丝心蛋白的构成成分，而是作为水溶性肽可以在后部绢丝腺中简单且大量地表达及分泌，则通过其高的蛋白质合成能力可以提高使用转基因蚕的有用肽的生产效率，另外，由此也可以降低制造成本。因此，本专利技术的目的在于，开发一种在以家蚕为代表的绢丝虫的后部绢丝腺中可以大量地表达、分泌水溶性重组肽的后部绢丝腺基因表达单元，提供该基因表达单元被转入其中的转基因绢丝虫。为了解决上述课题，本专利技术人等反复进行潜心研究，使编码将外来的水溶性肽与来自在中部绢丝腺细胞中特异性地表达的蛋白质的信号肽连接的嵌合肽的基因在后部绢丝腺中表达，结本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种后部绢丝腺基因表达单元，其包含：编码在后部绢丝腺中特异性地表达的蛋白质的基因的启动子；及与该启动子的下游功能性地连接的编码来自在中部绢丝腺中特异性地表达的蛋白质的信号肽的DNA；及连接于其下游的编码不含有丝心蛋白的构成蛋白质的肽的DNA。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.12.25 JP 2012-2813301.一种后部绢丝腺基因表达单元，其包含：编码丝心蛋白H链、丝心蛋白L链或p25中任一个的基因的启动子；及与该启动子的下游功能性地连接的编码来自丝胶蛋白1～3中任一个的信号肽的DNA；及连接于其下游的编码不含有丝心蛋白的构成蛋白质的肽的DNA。2.一种后部绢丝腺基因表达单元，其由(a)第1辅助单元和(b)第2辅助单元构成，其中，所述第1辅助单元包含：编码丝心蛋白H链、丝心蛋白...
【专利技术属性】
技术研发人员：立松谦一郎，瀬筒秀树，内野恵郎，饭塚哲也，
申请(专利权)人：国立研究开发法人农业生物资源研究所，
类型：发明
国别省市：日本;JP
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