为了试样(12)的具有发光体(6)的结构(15)的空间高分辨率成像，对试样(12)在测量区域(13)中加载以发光阻抑光(10)的具有局部最小处(14)的强度分布。然后对试样(12)在测量区域(13)中加载以发光激发光(1)，发光激发光将发光体(6)从电子基态(S0)激发到发光态，记录从测量区域(13)发射的冷光(2)。将记录的冷光(2)对应于所述局部最小处(14)在试样(12)中的位置。用发光阻抑光(10)干扰发光体(6)的电子基态，使得发光体(6)在被干扰的电子基态中具有用于发光激发光(1)的减小至少50％的吸收横截面。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于试样的具有发光体的结构的空间高分辨率成像的方法
本专利技术涉及一种用于试样的具有发光体的结构的空间高分辨率成像的方法，其中，对试样在测量区域中以发光阻抑光的具有局部最小处的强度分布加载，其中，对试样在测量区域中以发光激发光加载，所述发光激发光使发光体从电子基态出发被激发到发光状态，其中，记录从测量区域所发射的冷光，并且，将所记录的冷光对应于所述局部最小处在试样中的位置。在这样的方法中，由测量区域所发射的冷光的强度是发光体在局部最小处在试样中的位置上的浓度的尺度。通过在局部最小处的每个位置上重复上述步骤来扫描具有局部最小处的试样，检测发光体在试样中的分布并且因此对具有发光体的结构成像。在这里，用术语“发光体”是指这样的任意物质：当其处于被激发的发光态时，从该物质可获得作为测量信号的荧光。荧光染料尤其属于这样的物质。但是，该以基于冷光发射的过程不必是荧光。也可以涉及散射、例如Raman散射，在所述散射中，从被激发的过渡状态发射散射光，所述被激发的过渡状态被看作被激发的发光态。试样的让人感兴趣的结构可以本身具有发光体，即为自动发光的。然而，试样的让人感兴趣的结构也可以以发光体人工标记。以发光体对结构的人工标记例如可以通过所谓的抗体染色、即通过发光体通过免疫反应连接，或者通过基因技术的改变来进行，所述基因技术的改变导致发光体与让人感兴趣的结构的共同表达。如果在这里谈到一种状态、例如发光体的可激发的电子基态或者被激发的发光态，则涉及发光体的能发光的最小单元即分子、复合物、缺陷处、量子点或者诸如此类的电子状态。如果在这里谈论的是光、例如发光阻抑光的强度分布的局部最小处，则以此尤其指的是强度分布的由干涉所产生的零位置。这样的零位置可以具有四个比它在光聚焦时由于衍射极限而可能的更小的尺寸。在此也能涉及真实的零位置，在该零位置中，光的强度实际上返回到零，或者涉及一种这样的零位置：在该零位置中，光的强度由于缺乏理想的光学情况而仅基本上返回到零。如果在这里谈到局部最小处的大小，则该大小尤其涉及体积的大小，在该体积中，相应的光造成通过该光所追求的效果、例如通过该光激发过渡未至饱和。
技术介绍
一种已知的用于试样的具有发光体的结构在空间上高分辨率成像的方法作为GSD(基态耗竭，GroundStateDepletion)网栅荧光显微镜已知，该方法以上述顺序包括独立权利要求1前序部分的步骤。在这种已知的方法中，以呈GSD光形式的发光阻抑光使发光体经过其电子被激发发光态、例如电子被激发单重态转为暗态、例如长寿命的三重态，发光体不被发光激发光从暗态激发到发光态。这发生在发光阻抑光的强度分布的局部最小处之外各处，直至饱和。即，在以发光阻抑光加载之后，只在发光阻抑光的强度分布的局部最小处中发光体还处于其电子基态，发光体被发光激发光从电子基态激发到发光态。因此，在以发光激发光激发之后，由发光体发射的冷光仅来自发光阻抑光的强度分布的局部最小处，因此对应于局部最小处在试样中的位置。在以关键词GSD已知的方法中也存在发光体褪色的巨大风险，因为发光体不但在其被以发光阻抑光所转换到的长寿命的暗态中而且在其在转到其暗态中时中间占据的电子激发的发光态中以提高的程度例如倾向于与氧气化学反应和/或承受这样的风险：发光体被发光阻抑光或者发光激发光进一步电子激发，从而发生发光体的光化学褪色。另一种用于试样的具有发光体的结构的空间高分辨率成像的方法作为RESOLFT(可逆饱和荧光过渡ReversibleSaturableOpticalFluorescenceTransitions)网栅荧光显微镜的变型已知，该RESOLFT网栅荧光显微镜使用所谓可转换的发光体，该方法以上述顺序具有独立权利要求1前序部分的方法步骤。借助于呈关断光形式的发光阻抑光可将发光体从它在其中起发光体作用的第一构象状态转换到它在其中不起发光体作用的第二构象形态，即，在第二构象状态中，至少借助于在第一构象状态下适合于激发发光态的发光激发光不能将发光体激发到发光态，在发光态下，发光体发射被记录为测量信号的冷光。为了在发光阻抑光的强度分布的局部最小处之外各处促进这样的转换直至饱和，在第二构象状态的寿命足够长的情况下，仅需要相对小的光强度。此外不存在被转换到其另一构象状态中的发光体从该另一构象状态褪色出来的显著风险，因为发光体在该构象状态下对发光阻抑光和发光激发光不响应。然而，可转换的发光体借助于发光阻抑光向其第二构象状态的转换也经过被激发的电子态进行，该被激发的电子态在发光阻抑光的强度较高的情况下可以是用于发光体的光化学褪色的起点。由于该原因和其它原因，在有多个可转换的发光体时，两种构象状态之间的可用的转换过程的绝对数量是受限的，尤其当发光体根据需求主动地、即通过发光促进光从其不能发光的第二构象状态切换到其能发光的第一构象状态时。此外，即使在所述构象状态之间主动地来回切换，所述构象状态的已经提到的长寿命意味着：以关键词RESOLFT已知的用于试样的具有可转换的发光体的结构的空间高分辨率成像的方法也相对较慢。最后，商业上可用的适合于标记试样中的结构的可转换发光体的数量是有限的，尤其与大量原则上可用的发光体相比。而且开发新的稳定的可转换发光体是费事的。一种用于试样的具有发光体的结构的空间高分辨率地成像的方法作为STED(受激辐射耗竭)网栅荧光显微镜已知，该方法以原则上与开头部分所列举的不同的顺序包括独立权利要求1前序部分的方法步骤。在这里，首先对试样在测量区域中以发光激发光加载，发光激发光将发光体从电子基态激发到发光态。然后对试样在测量区域中以呈STED光形式的发光阻抑光的具有局部最小处的强度分布加载，发光阻抑光使被激发的发光态通过受激发射再退激发到基态。当发光阻抑光使被激发的发光态在局部最小处之外各处通过受激发射又被退激发时，接着由测量区域发射的荧光只可能来自发光退激发光的强度分布的局部最小处，因此对应于局部最小处在试样中的位置。在以关键词STED已知的方法中，在试样的具有发光体的结构的成像中实际也达到非常高的地点分辨率。然而在此，发光体显著承受光化学负荷并且因此强烈地倾向于褪色。原因在于，发光退激发光加载已经处于其被激发的发光状态下的发光体，该发光退激发光为了约束其强度分布的呈零位置形式的局部最小处而必须以高的绝对强度来施加。因此，除了所希望的使发光体返回其基态的受激发射外，其它过程、尤其发光体的在更大程度上并且导致褪色的电子激励也不是不可能的。对起先通过手激发射而被退激发的发光体的重新激发也可通过本来设置用于荧光退激发的光发生。所有已知的、具有独立权利要求1前序部分的特征的、用于试样的具有发光体的结构的空间高分辨率成像的方法基于：发光阻抑光使发光体或者在发光激发光射入之前从其能发光的基态经过被激发的电子态转换到暗态，或者从被激发的发光态返回到基态。即，在任何情况下，发光体被加载以高强度的、具有在发光体的吸收光谱中的波长的发光阻抑光，并且，与发光体的光化学褪色危险相关联的、被激发的电子态借助于发光阻抑光而参与到地点分辨率的提高中。而且，似乎在暗态寿命和必需的发光阻抑光强度之间产生关联，暗态寿命越长，该关联越少可能失效。
技术实现思路
本专利技术的任务是，提出一种用于试样的具有发光体的结构的空间高本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于试样(12)的具有发光体(6)的结构(15)的空间高分辨率成像的方法，‑其中，对所述试样(12)在测量区域(13)中以发光阻抑光(10)的具有局部最小处(14)的强度分布加载；‑其中，对所述试样(12)在所述测量区域(13)中以发光激发光(1)加载，所述发光激发光将所述发光体(6)从电子基态(S0)出发激发到发光态(S1)；‑其中，记录从所述测量区域(13)发射的冷光(2)，并且‑其中，将所记录的冷光(2)对应于所述局部最小处(14)在所述试样(12)中的位置，其特征在于，以所述发光阻抑光(10)这样干扰所述发光体(6)的所述电子基态(S0)，使得所述发光体(6)在被干扰的电子基态(S0)中具有用于所述发光激发光(1)的减小至少50％的吸收横截面。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.01.09 DE 102013100174.21.用于试样(12)的具有发光体(6)的结构(15)的空间高分辨率成像的方法，-其中，对所述试样(12)在测量区域(13)中以发光阻抑光(10)的具有局部最小处(14)的强度分布加载；-其中，对所述试样(12)在所述测量区域(13)中以发光激发光(1)加载，所述发光激发光将所述发光体(6)从电子基态(S0)出发激发到发光态(S1)；-其中，记录从所述测量区域(13)发射的冷光(2)，并且-其中，将所记录的冷光(2)对应于所述局部最小处(14)在所述试样(12)中的位置，其特征在于，以所述发光阻抑光(10)这样干扰所述发光体(6)的所述电子基态(S0)，使得所述发光体(6)在被干扰的电子基态(S0)中具有用于所述发光激发光(1)的减小至少50％的吸收横截面。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发光阻抑光(10)具有在所述发光体(6)的发光激发光谱和/或荧光发射光谱之外的波长。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述发光体(6)的电子基态(S0)被分子的运动脉冲和/或振动干扰。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述运动脉冲或者振动从至少一个被所述发光阻抑光(10)激发的调制器单元(5)发出。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述至少一个调制器单元(5)在空间上配属于所述发光体(6)。6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述至少一个调制器单元(5)化学地结合在所述发光体(6)上。7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发光阻抑光(10)激发所述调制器单元(5)至顺-反异构化。8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在被干扰的电子基态(S0)中，所述发光体(6)中的原子排列被干扰。9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述发光体(6)在被干扰的电子基态(S0)中不处于与其环境的热平衡中。1...
【专利技术属性】
技术研发人员：S·W·黑尔，
申请(专利权)人：马克思普朗克科学促进协会，
类型：发明
国别省市：德国;DE
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