肝源性表达NG2的干细胞群作为种子细胞在体外3‑D培养重建人工肝脏中的应用及方法技术

本发明专利技术公开了肝源性表达NG2的干细胞群(NG2

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医学领域，具体涉及肝源性表达神经-胶质抗原2阳性细胞群(NG2+HSC)作为种子细胞通过条件培养基微环境在体外3-D培养诱导NG2+HSC重建肝脏器官中的应用，还涉及利用NG2+HSC重建肝脏器官的方法。
技术介绍
终末期肝病(End-stageliver diseae, ESLD)包括肝硬化(Liver cirrhosis)和急性肝衰竭(Acute liver failure)死亡率高，严重危害人类健康。而当前唯一有效治疗手段是肝移植，但是肝移植又受到供体匮乏原因故难以广泛应用。因此，寻找有效的肝脏功能替代技术是解决这一问题的关键。目前借助体外等暂时辅助或替代肝脏等人工肝脏方法，例如生物型人工肝脏(B1artificial liver，BAL)和物理型人工肝脏，虽然能够清除因肝衰竭产生或增加的各种有害物质，补充需肝脏合成或代谢的蛋白质等必须物质，改善患者水、电解质及酸碱平衡等内环境，但BAL只是暂时改善了晚期肝病患者症状，始终无法实现肝脏功能的全部替代。虽然近年发展的天然去细胞肝脏支架已取得进步，但由于缺乏有效的种子细胞以及诱导其生成功能性全肝器官的微环境，故使最大程度仿造原有肝脏器官以达到制成工程化的新器官的目的至今世界科学家们未能如愿以偿。为此，急需提供一种生成功能性全肝的种子细胞，通过科学培养，能够生成工程化的新型肝脏样器官。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供生成功能性全肝的种子细胞即NG2+HSC，该细胞经培养后能够发育为类肝样组织，并具有肝脏结构和功能；本专利技术的目的之二在于提供利用NG2+HSC细胞群在体外重建人工肝脏的方法。为实现上述专利技术目的，经研宄，本专利技术提供如下技术方案:1、肝源性表达神经胶质抗原2的干细胞群NG2+HSC作为种子细胞在体外3-D培养重建人工肝脏中的应用。本专利技术所指的肝源性表达神经胶质抗原2的干细胞群是表达神经-胶质抗原2 (Neuro-glia antigen2，NG2)的肝源性干细胞 / 祖先细胞(Hepatic stem/progenitorcells, HSC)(简称为NG2+HSC)，NG2+HSC可以来源于胚胎期未发育成熟的肝脏，也可以来源于成体肝脏，来源于成体肝脏的表达神经胶质抗原2的干细胞群制备方法见公开号为102899291A的中国专利，也可以使用现有技术中的其他方法分离，即只要肝源性的具有发育学特性和干细胞潜能的NG2阳性细胞群同样能够实现本专利技术目的。2、肝源性表达神经胶质抗原2的干细胞群NG2+HSC作为种子细胞在体外3-D培养重建人工肝脏的方法，包括如下步骤:将NG2+HSC注入全肝去细胞生物支架(Wholedecellualrized liver scaffold,WDLS)中，然后加入能使NG2+HSC重建为人工肝脏的条件培养基，模拟肝组织器官发育的微环境体外3-D培养，诱导NG2+HSC生成(重建)人工肝脏。本专利技术中的WDLS可以按照本领域现有的方法制备，优选的，所述WDLS按如下方法制备:(I)取离体全肝供体，然后从腹主动脉灌注生理盐水洗出红细胞；(2)从门静脉和肝动脉同时灌注无菌双蒸水开始去除细胞成分；(3)从门静脉和肝动脉同时灌注SDS-Trypsin-EDTA混合液继续去除细胞成分；所述SDS-Trypsin-EDTA混合液中含SDS，胰酶和EDTA ；(3)从门静脉和肝动脉灌注无菌双蒸水洗出SDS-Trypsin-EDTA混合液；(4)从门静脉和肝动脉灌注无菌I XPBS，恢复生理状态，制得全肝去细胞生物支架。更优选的，按如下步骤制备全肝去细胞生物支架:(I)取离体全肝供体，然后以速度为5mL/min体内腹主动脉灌注生理盐水0.5小时；(2)以5mL/min速度从门静脉和肝动脉同时灌注无菌双蒸水2小时；(3)以5mL/min速度从门静脉和肝动脉同时灌注SDS-Trypsin-EDTA混合液48小时，所述SDS-Trypsin-EDTA混合液中含质量分数为1%的SDS，质量分数为0.005%的胰酶和质量分数为0.002%的EDTA ；(4)以5mL/min速度从门静脉和肝动脉同时灌注无菌双蒸水6小时；(5)以5mL/min速度从门静脉和肝动脉同时灌注无菌I XPBS 1.5小时，制得全肝去细胞生物支架。本专利技术中，能使成体肝脏NG2+HSC通过体外3_D诱导培养重建为人工肝脏的条件培养基均可实现，优选的，所述能使成体肝脏NG2+HSC通过体外3-D诱导培养重建为人工肝脏的条件培养基包括CMl培养基，CM2培养基和CM3培养基；所述CMl培养基(诱导内皮细胞分化和维持其生长)为含有内皮细胞生长因子(Endothelial cell growth supplements，ECGS)、细胞破碎并去除细胞碎片的哺乳动物发育期肝脏滤液和DMEM完全培养液的混合液，所述细胞破碎并去除细胞碎片的哺乳动物发育期肝脏滤液和DMEM完全培养液的体积比为1:4;所述CM2培养基(诱导肝前体细胞分化和维持其生长)为含有肝细胞生长因子(Hepatic growth factor，HGF)、喊性成纤维生长因子(Fibroblast growth factor，bFGF)、牛胰岛素、人转铁蛋白、左旋甲状腺素、亚砸酸钠、腐胺、孕激素、细胞破碎并去除细胞碎片的哺乳动物发育期肝脏滤液和DMEM完全培养液的混合液，所述细胞破碎并去除细胞碎片的哺乳动物发育期肝脏滤液和DMEM完全培养液的体积比为1:4 ;所述CM3培养基(诱导成熟肝细胞分化和维持其生长)为含有肝细胞生长因子、碱性成纤维生长因子(Pepnotech, cat.n0.100-188)、抑瘤素(Oncostatin)M、地塞米松、细胞破碎并去除细胞碎片的哺乳动物发育期肝脏滤液和DMEM完全培养液的混合液，所述细胞破碎并去除细胞碎片的哺乳动物发育期肝脏滤液和DMEM完全培养液的体积比为1:4 ;所述DMEM完全培养液包括如下组分:100U/mL青霉素-G，100 μ g/mL链霉素，5mML-谷氨酰胺，I X非必须氨基酸(原液为100X)，1X丙酮酸钠(原液为100X)和25mMHEPESo更优选的，所述CMl培养基中，内皮细胞生长因子的浓度为20ng/mL ；所述CM2培养基中，肝细胞生长因子的浓度为10ng/mL，碱性成纤维生长因子的浓度为5ng/mL，牛胰岛素的浓度为0.5mg/mL，人转铁蛋白的浓度为0.5mg/mL，左旋甲状腺素的浓度为40 μ g/mL,亚砸酸钠的浓度为34 μ g/mL,腐胺的浓度为0.5 μ g/mL,孕激素的浓度为 6 μ g/mL ；所述CM3培养基中，肝细胞生长因子的浓度为100ng/ml，碱性成纤维生长因子的浓度为50ng/mL、抑瘤素M的浓度为20ng/mL、地塞米松的浓度为0.1 μΜ。使用本专利技术的条件培养基成本较低、经济适用，培养周期短，21天即能形成完整的肝脏器官样轮廓。进一步，本专利技术CMl培养基，CM2培养基和CM3培养基中由于使用胚胎期哺乳动物肝脏滤液，为防止培养基中其他细胞的增殖，特别是胚胎干细胞或祖先细胞的繁殖，因此需要将细胞破碎破坏细胞的增殖特性，然后过滤去除细胞碎片制得细胞破碎并去除细胞碎片的哺乳动物本文档来自技高网...

【技术保护点】
肝源性表达神经胶质抗原2的干细胞群NG2+HSC作为种子细胞在体外3‑D培养重建人工肝脏中的应用。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：白莲花，帅领，赖洁娟，张玉君，赖向东，张宏宇，别平，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：重庆;85