本发明专利技术涉及通过阻抗微流式细胞术区分原料奶样品中的细胞与其它颗粒、以及细胞的不同类型的方法。更确切地，其描述一种就其细菌和体细胞含量而言不需要奶样品预处理使得分析可以直接在生产场地进行的分析原料奶质量的方法。本发明专利技术的一个优点是通过对未处理原料奶直接进行的高频阻抗分析从奶颗粒(主要由脂质囊泡组成)区分和计数体细胞。本发明专利技术的另一个优点是该方法允许根据所述体细胞计数的分析在挤奶后直接诊断乳腺炎感染的状态。本发明专利技术的另一个优点是允许一种快速的用于在挤奶后直接确定原料奶中细菌细胞计数的方法。此外，体细胞和细菌细胞的生存力都可以被确定而不需要任何细胞标记。进一步的优点是，所述分析可以直接在原料奶已经通过微流体器件的微通道后实时获取。
【技术实现步骤摘要】
【专利说明】用于区分奶中细胞负载的方法和装置
技术介绍
本专利技术涉及一种用于通过阻抗微流式细胞术区分原料奶样品中细胞和其它颗粒， 以及细胞不同类型的方法。 在限定奶质量的许多参数中，细菌（BCC)和体细胞计数（SCC)是最为重要的，因为 它们显著影响所获得的奶产品的质量，而且还提供有关奶牛健康状况的信息。 体细胞是被称为白细胞（淋巴细胞、粒细胞、单核细胞和巨噬细胞）的白血细胞， 并来源于动物的乳房。这些细胞的数目可响应于细菌感染而增加，这可以导致乳腺炎。通 常，未感染奶牛的奶具有小于1〇〇, 〇〇〇个细胞/毫升，高于300, 000个细胞/毫升的值表示 感染的奶牛，而对于患病的奶牛超过1，〇〇〇, 〇〇〇个细胞/毫升的值是典型的。对于人类食用 或对于进一步加工为供人类食用的食品的阈值在欧洲低于400, 000个细胞/毫升，但在美 国可以更高。一般情况下，SCC高于300, 000个细胞/毫升的奶牛视为被感染（Smith，K.L.， in STANDARDS FOR SOMATIC CELLS IN MILK :PHYSIOLOGICAL AND RE⑶LATORY(1996)， International Dairy Federation Mastitis Newsletter，9月，第7 页）。因此，为了评价奶 质量，可靠和精确的体细胞计数方法是必需的。简单且经常被使用的牛侧加利福尼亚乳腺 炎测试（在EXPERIMENTS AND OBSERVATIONS LEADING TO DEVELOPMENT OF THE CALIFORNIA MASTITIS TEST，Journal of the American Veterinary Medical Association (1957)： 130,199-204中根据它的专利技术人Schalm和Norlander也称为Schalm测试）是间接的、定性 的方法，并且没有提供这种详细信息以定性人类食用奶的质量。 通常，在卸载奶卡车后在乳制品制造商的实验室，每天对来自许多动物而不是来 自个别奶牛的混合奶进行SCC测量。主要原因是因为每次挤奶时的个别动物的测试将过 于昂贵。这也意味着，来自患病奶牛的奶会被健康动物稀释并且平均下来。因此，患病动 物可能在后期仍然不被检测到或发现是生病的，而不影响整体的奶质量评价。此外，也由 于几个农场主的奶混合在一起，所以根据奶负载的平均评价补偿农场主。然而，乳制品制 造商宁愿根据每个农场主的奶的每日配送质量补偿每个农场主，这目前这是不可行的。昂 贵的分析主要涉及到基于光学或电气测量的现有技术。光学测量首先需要在分析前将细 胞标记，因此这通常需要昂贵的化学试剂或耗材。另一方面，电气测量，是基于阻抗分析， 但是，利用阻抗分析，其它非细胞奶颗粒会干扰，并且必须通过几个离心步骤被去除。因此 这些器件不能在农场主的场地使用。因此，要进行许多努力以简化分析方法和降低分析成 本。无标记技术是优选的方法，因为这些技术通常不需要试剂和耗材，并且同时简化了样品 制备过程。迄今所使用的电动工具是所谓的库尔特计数器，它可以计数细胞并且通过大小 区分它们。因为原料奶中含有许多颗粒，主要是与白细胞（5-10微米）具有类似尺寸的脂 肪囊泡，可靠的细胞计数是不可能的，因为这些颗粒容易多于体细胞，并且因此严重干扰测 量。因此，在测量前这些颗粒必须从体细胞中分离出来。这可以通过离心实现，离心时细胞 被沉淀而脂肪囊泡从上清液中被除去，或者，如最近由Grenvall等人于2012年10月18日 在 Cytometry A 上在线发表的 LABEL-FREE SOMATIC CELL CYTOMETRY IN RAW MILK USING A⑶ST0PH0RESIS(2012)中显示的，采用声波技术使脂肪囊泡与体细胞分离。虽然离心通常 需要实验室的基础设施，声泳似乎更有前景，但也使库尔特计数器技术进一步复杂化。 传统库尔特计数器采用直流（DC)或低频交流电流（AC，最大1千赫兹）测量阻 抗，允许可靠的细胞计数和细胞大小区分。这种技术已经在过去十年中通过微技术的问 世而得到改进。EP 1 335 198 Bl公开了具有电极配置的微流体方法，其允许覆盖宽频率 范围（100千赫-20兆赫）的细胞阻抗分析。高频分析超出了简单的细胞计数和分选并 且探询细胞的介电特性，其允许在各种应用中的细胞区分，诸如Schade-Kampmann等人在 标题为 ON-CHIP NON-INVASIVE AND LABEL-FREE CELL DISCRMINATION BY MPEDANCE SPECTROSCOPY，Cell Prolif. (2008)，41，830-840 中显示的细胞差异，或 Pierzchalski 等 人在标题为 LABEL-FREE HYBRIDOMA CELL CULTURE QUALITY CONTROL BY A CHIP-BASED MPEDANCE FLOW CYTOMETER，Lab Chip (2012)，12 (21)，4533-4543 中以及 David 等人在标 题为 VIABILITY AND MEMBRANE POTENTIAL ANALYSIS OF BACILLUS MEGATERIUM CELLS BY MPEDANCE FLOW CYTOMETRY， Biotechnology&Bioengineering(2012)，109(2)，883-492 中 分别描述的动物和细菌细胞生存力。与其中信号幅值是用于计数和依大小分选细胞的传统 库尔特计数器测量相反，高频分析提供额外的信息，即使这些细胞具有相同的尺寸。但是， 这种分析还只在实验室环境中实施，其中细胞悬浮于明确定义的介质中。 美国专利2012/0310541 Al中已经公开了在巨大频率范围（0.3兆赫-1.4千兆 赫）采用阻抗分析用于分析奶中各种细胞参数的方法。在100兆赫至2千兆赫之间的射频 范围以各种频率对奶的阻抗测量可以提供关于体细胞浓度的指征，但是在一个相对定性的 水平，因为该分析不是在单细胞水平进行的。该方法不够灵敏，不足以以能够用于评价奶质 量的方式确定SSC。 预期的是奶颗粒（脂质囊泡）和体细胞在它们的细胞内部的介电性质方面表现不 同，如同 Cheung 等人在 MPEDANCE SPECTROSCOPY FLOW CYTOMETRY :0N-CHIP LABEL-FREE CELL DIFFERENTIATION，Cytometry A(2005)，65A，124-132 中预计的。 已经显示，以范围至多达0.1 兆赫的频率对单细胞的阻抗分析允许分割幅值 和相位角分量并允许将细胞区分于非细胞颗粒以及区分活/死细胞（Conrad等人在 IMPEDIMETRIC AND OPTICAL INTERROGATION OF SINGLE CELLS IN A MICROFLUIDIC DEVICE FOR REAL-TIME VIABILITY AND CHEMICAL RESPONSE ASSESSMENT,Biosensors and Bioel本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种在微流体器件中，在0.1至30兆赫之间的范围内，采用高频阻抗测量用于自动区分和计数任何动物奶中的颗粒诸如细胞或脂肪球的方法，包括：‑使原料奶通过一个过滤器，以避免堵塞所述微流体器件；‑确定所述奶的阻抗值并根据所述阻抗值校准所述微流体器件，如果需要的话，‑计数所述颗粒并测量每个颗粒的阻抗分量；‑从这些分量中的一个确定分别适于噪声提取和颗粒识别的触发电平；‑从一个阻抗分量确定用于将细胞区分于非细胞奶颗粒的触发电平；‑依据所述幅值和所述相位角值分析所述阻抗值；以及‑根据它们的幅值和/或相位角值区分和计数所述细胞和/或非细胞奶颗粒。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：M·迪贝拉尔迪诺，G·沙德坎普曼，
申请(专利权)人：安弗西斯股份公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH
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