本发明专利技术建立了一种通过融合表达艾塞那肽或其衍生物的新方法。该方法以水蛭素(分子量7Kd)为融合伴侣，将艾塞那肽或其衍生物拼接于其下游进行融合表达，并在水蛭素融合伴侣与艾塞那肽或其衍生物之间设计一个连接肽，其中包含TEV酶(烟草蚀纹病毒蛋白酶)识别切割序列ENLYFQH。融合蛋白表达后可通过TEV酶切释放出具天然N-末端和生物活性的艾塞那肽或其衍生物。其它优点：(1)水蛭素融合伴侣较小，可有效增加艾塞那肽或其衍生物在融合蛋白中所占比率；(2)水蛭素融合蛋白具抗凝活性，方便进行实时检测与追踪；(3)可采用价廉大孔吸附树脂对融合蛋白进行吸附；(4)水蛭素融合伴侣可增强艾塞那肽或其衍生物稳定性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程制药领域，涉及建立一种制备具有天然N-末端的艾塞那肽 或其衍生物的新方法。该方法的技术特征是：以水蛭素为融合伴侣（标签）制备重组艾塞 那肽或其衍生物，并在在融合伴侣水蛭素与目的产物艾塞那肽或其衍生物之间设计一个连 接肽，该连接肽包含TEV酶（烟草蚀纹病毒蛋白酶）识别切割序列ENLYFQH，这样融合蛋白 表达纯化后便可通过TEV酶切释放出N-末端与野生型艾塞那肽完全一致且具有生物活性 的目的产物艾塞那肽。 技术背景 糖尿病（diabetes mellitus，DM)是由体内胰岛素分泌不足或合成受阻导致 内分泌代谢紊乱而引起血糖升高的一种复杂的代谢疾病，主要分为1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，TlDM)、2 型糖尿病（type2 diabetes mellitus，T2DM)以及其他类型 的糖尿病。据统计，2型糖尿病所占比例较大，约占糖尿病患者总数的90%以上，其发病多 发期在35-40岁以后，发病后期会出现较严重的并发症。目前，糖尿病的治疗主要集中在以 降低血糖浓度，减少并发症的发生等为目的，主要治疗方法是药物治疗。治疗2型糖尿病的 药物主要有磺酰脲类、双胍类、α葡萄糖激酶抑制剂、抗IL-I β抗体和肠促胰岛素类药物， 其中肠促胰岛素类药物具有多方面降糖功能而作为新型糖尿病治疗药物备受关注，根据作 用机制可分为二肽基肽酶IV(dipeptidylpeptidase 4, DPP-4)抑制剂和胰高血糖素样肽 (glucagon-like peptide-1，GLP-1)受体激动剂两类。研宄表明，这两类药物除具有降血 糖、极少导致低血糖、安全性和耐受性较好等优点外，还对消化、中枢神经、心血管等多系统 发挥保护作用。 膜高血糖素样狀-I (Glucagon-1 ike Peptide-1，GLP-1)由小肠 Langerhans 细胞合成分泌，与GLP-I受体结合后能够随着血糖的升高而促进胰岛素的生物合成、刺 激胰岛β细胞分泌胰岛素、抑制胰高血糖素的分泌、增强组织对胰岛素的敏感性，从而 降低血糖浓度，对糖尿病具有良好的治疗效果，但GLP-I分泌入血后极易被二肽基肽酶 IV(dipeptidylpeptidase 4，DPP-4)降解，半衰期只有 l_2min。DPP-4 是一种丝氨酸蛋白 酶，可特异性切割GLP-IN端二肽使其失活。 艾塞那肽（Exendin-4)是从北美洲西北部钝尾毒蜥唾液中分离得到的一种GLP-I 受体激动剂，由39个氨基酸组成，与GLP-I氨基酸序列具有约53%的同源性，在哺乳动物体 内，该多肽的生理功能与GLP-I相似，能够刺激葡萄糖依赖性的胰岛素分泌。Exendin-4是 首个上市的GLP-I受体激动剂，在临床上与磺酰脲类药物、二甲双胍或噻唑烷二酮类药物 合用，能有效地控制2型糖尿病患者的血糖浓度，且在体内具有良好的安全性和耐受性，极 少导致低血糖现象。Exendin-4对二肽基肽酶IV不敏感，体内半衰期长达2-3个小时，对 2型糖尿病具有较好的临床治疗效果，因此，成为国内外研宄降糖药的热点。然而，从毒蜥 唾液中提取天然Exendin-4,产量太少，而且成本很高，无法满足临床需要。目前Exendin-4 主要通过化学合成的方法制备，但步骤多、成本高、收率低。因此，采用基因工程技术合成 Exendin-4提供了一条新途径。 当采用基因工程技术表达外源性多肽或小分子蛋白时，表达产物往往会由于被宿 主细胞内的蛋白酶降解而造成表达量大大降低。为了有效解决这一问题，目前普遍采用融 合表达技术。采用融合伴侣（标签）进行融合表达的优点在于：（1)对分子量较小的外源目 的小分子蛋白（多肽）进行融合表达可增强表达产物的稳定性，减少或避免宿主细胞蛋白 酶对表达产物的降解；(2)某些融合伴侣（标签）可以增强目的蛋白或多肽的可溶性；（3) 方便目的蛋白的分离纯化。 目前普遍使用在低等生物或细菌中以可溶性状态高表达的蛋白作为融合伴侣 (标签）以提高目的小分子蛋白（多肽）的表达量、可溶性及稳定性，采用的融合伴侣（标 签）有曼氏血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶（GST，28kDa)、大肠杆菌麦芽糖结合蛋白（MBP， 40kDa)、蛋白二硫化物异构酶（NusA，55kDa)、大肠杆菌二硫键异构酶（Dsb A，21kDa)等。 然而，在使用上述这些融合伴侣（标签）对小分子目的蛋白（多肽）进行取融合 表达时，虽然融合蛋白容易得到高水平表达，但由于融合伴侣（标签）自身分子量偏大，小 分子目的蛋白（多肽）在融合蛋白中所占的比率相对较低（通常仅占到融合蛋白的1/5~ 1/10甚至更低），这样就势必严重影响了小分子目的蛋白（多肽）的最终收率。 水蛭素是一类从医用水蛭唾液腺中分离得到的抗凝抗栓多肽物质，分子量为7Kd， 由65-66个氨基酸残基组成，是目前发现的最强的凝血酶特异性抑制剂，且分子结构非常 稳定，我们已在大肠杆菌中获得高分泌表达（J Ind Microbiol Biotechnol，2012, 39(10): 1487-1494.)。根据水蛭素分子的结构特征，以其为融合标签建立的融合表达系统，具有以 下优点：（1)水蛭素融合伴侣分子量（7KD)较小，可以有效增加小分子目的多肽在融合蛋白 中的比率；（2)通过分析水蛭素融合蛋白的抗凝活性可以方便快捷地对重组融合蛋白的表 达水平进行实时检测和追踪；（3)利用水蛭素融合伴侣N-端的疏水特性，可以采用价格低 廉的大孔吸附树脂（如HP20)对融合蛋白进行吸附和纯化；(4)将水蛭素融合伴侣与艾塞 那肽融合后可避免宿主细胞蛋白酶对目的产物艾塞那肽的降解，增强目的产物艾塞那肽的 稳定性，提高目的产物艾塞那肽的最终表达量。
技术实现思路
本专利技术目的在于建立一种融合表达艾塞那肽（Exendin-4)的新方法。 本专利技术以水蛭素为融合伴侣，将小分子目的多肽Exendin-4拼接于水蛭素融合伴 侣下游进行融合表达，为了能够获得目的多肽，在融合伴侣和目的多肽之间设计一个连接 肽，该连接肽包括TEV酶识别序列，这样可以在融合蛋白表达纯化后进行特异性酶切割以 释放出N-末端与野生型艾塞那肽完全一致且具生物活性的目的产物艾塞那肽。 本专利技术以小分子水蛭素（分子量7KD)为融合伴侣对艾塞那肽（分子量4KD)进行 融合表达，增加了目的产物在融合蛋白中所占的比率，从而最终提高了目的产物艾塞那肽 的产量。 本专利技术将水蛭素融合伴侣与艾塞那肽融合后仍具有抗凝活性，这样就可通过分析 融合蛋白的抗凝活性方便快捷地检测融合蛋白的表达水平，并在纯化过程中对其实时追 足示。 本专利技术将水蛭素融合伴侣与艾塞那肽融合后可避免宿主细胞蛋白酶对目的产物 艾塞那肽的降解，增强目的产物艾塞那肽的稳定性，提高目的产物艾塞那肽的最终表达量。【附图说明】 图1 :融合蛋白rHV3-Exendin-4的编码基因序列。灰色部分为水蛭素 III (HV3)融 合标签，其后为-GGGGSENLYFQH-连接肽（其中ENLYFQH为TEV酶识别切割序列），箭头所指 为TEV酶（烟草蚀纹病毒蛋白酶）切割位点，切割位点之后为目的多肽艾塞那肽序列，*代 表终止密码子。 图2 :融合蛋白（rH本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种制备重组艾塞那肽或其衍生物的新方法，其特征是：以水蛭素为融合伴侣，将目的多肽艾塞那肽或其衍生物拼接于水蛭素融合伴侣下游进行融合表达。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：谭树华，张苗青，韩宁，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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